生物消油剂的研发及应用进展

王昕喆，谢谚，杨洋洋，张福良，闫茜，曲聪，盛学佳

(中国石油化工集团公司青岛安全工程研究院，山东 青岛 266100)

目前针对频发的海上溢油事故，主要的应急方法有控制燃烧法、机械回收法、消油剂法三大类。控制燃烧法快速有效，但是使用条件较为苛刻，考虑因素包括油品种类的燃烧性能、油品剩余挥发分含量以及油膜厚度等；机械回收法则有可实现资源回收的优点，但是回收效率往往很低，相比之下，消油剂则消除溢油效果明显，操作快速简单，但由于目前市面上大多为化学消油剂，大量喷洒会造成二次污染，因此已被明确限定使用。

生物消油剂的研发则有效弥补了化学消油剂的缺点，由于其本质为微生物或酶组分制剂，因此无二次污染、易于生态修复。但是经过调研发现目前市面上成熟生物消油剂产品种类较少，针对生物消油剂的研发仍大多集中于实验室的基础研究。基于上述情况，本文针对生物消油剂目前的研究现状进行了资料收集与分析整理，介绍了生物消油剂的发展现状与主要研究热点，并指出生物消油剂下一步的重点研究方向。

1 消油剂现状

1.1 生物消油剂种类

目前，生物降解石油的原理主要分为三类：一是利用高产表面活性剂菌种或其产生的生物表面活性剂，加快石油类物质的溶解乳化，促进石油烃大分子变成小分子，帮助本土微生物对石油类物质的代谢[1]；二是通过添加生物刺激剂，例如N/P等营养素刺激本土微生物的菌种繁殖和代谢[2]；三是直接添加本土或外源以石油类物质为碳源的高效石油降解菌，改变污染区域的菌群结构，提高石油降解菌占比，提高降解速率[3]。生物消油剂的主要基底成分也基本由三种组成：生物表面活性剂或高产表面活性剂的菌种、生物刺激剂以及高效石油降解菌。

生物表面活性剂大多是由微生物代谢产生的一种具有表面活性的物质，可以有效降低两相界面的张力。能够乳化油品，有效加速石油类物质的溶解。根据结构特征可以把生物表面活性剂分为脂肽类和脂蛋白类、糖脂类、磷脂类和脂肪酸类、中性脂类等[4]。目前文献报道的高产表面活性剂的菌种主要为假单胞菌属(Pseudomonas)、地衣芽孢杆菌属(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌属(Bacillussubtilis)、链霉菌属(Streptomyces)、不动杆菌属(Acinetobacter)、屎肠球菌属(Enterococcusfaecium)等[5]。Rocha等报道了铜绿假单胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC55925)可以产鼠李糖脂，能够有效降解直链烷烃C11～C21，降解率近乎可达100%[6]。典型生物表面活性剂及其来源微生物见表1。生物刺激剂的主要成分则为营养盐，石油中有丰富的碳源，N/P类的营养盐进入后可明显影响本地石油降解菌的生长繁殖，提高石油降解菌的降解效率。赵东风等[7]对克拉玛依石油污染土壤的修复研究中发现，鸡粪、麦糠、表面活性剂的定比例组合可以大大提高土壤修复速率。郭婷等[8]通过在混合菌剂中加入腐殖酸、肥料和生物有机钙等营养盐，加快了石油烃的去除效率。高效石油降解菌根据目前的研究，已知的就有100余属200多种，涵盖细菌、放线菌、霉菌、酵母等，主要包括芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、食烷菌属(Alcanivorax)、解环菌属(Cycloclasticus)等[9]。Wang等[10]则从重度含油污水灌溉区土壤中分离出分枝杆菌(Mycobacteriumsp.B2)，经过实验发现其对芘的生物降解率30 d可达到83.2%，很适宜用作生物修复。

表1 常见生物表面活性剂类型及其来源微生物Table 1 Types of common biosurfactants andtheir source microorganisms

1.2 主要固定化方式

生物固定化是得到生物消油剂产品的关键技术。它能够使微生物固定于特定环境，保证微生物的高密度存活，降低微生物流失或不可控扩散，是工程应用的前提[16]。目前的生物固定化方式主要为静电吸附法[17]和载体法[18]。静电吸附法主要是依靠静电作用与微生物的吸附作用，反应条件比较温和，微生物活化也比较快速。载体法主要是将微生物与载体材料相结合，对载体材料的要求较高，要求载体材料无毒、高稳定性。宋佳宇等[19]采用的固定方式为将生物载体材料改性(聚丙烯工业吸油棉)与生物消油剂基底进行离心固定，得到的生物制剂对石油烃的降解率明显高于游离态菌种降解率。目前使用较多的载体材料为活性炭和苎麻，因为其有大的吸附能力，好的传质性能与良好的生物降解性能[20-21]，姜军清等[20]在总结活性炭纤维应用研究进展时提到活性炭纤维可作为生物固定化载体用于污水处理，传质效能快、吸附容量大。郭贺等[21]则通过将苎麻用乙酸改性，发现其对溢油的吸附性能大大增加，是比较好的天然生物载体材料。Li等[22]加入活性炭固定化的微生物，在低浓度背景下，烃类降解率稳定在70%以上，明显优于游离微生物。张秀霞等[23]利用纳米氧化硅对石油降解菌进行固定，多次重复实验发现固定后明显提高菌群对石油烃的降解效果。

1.3 国内外现有产品

目前市面上的生物消油剂产品不多。国外的生物消油剂产品主要集中于生物表面活性剂的研发。Logos Technologies公司推出NatSurFact系列可降解表面活性剂，其原料为鼠李糖脂，鼠李糖脂也是最早的应用于土壤修复的一种生物表面活性剂[11]。但由于生产和提纯成本较高，定价也很高，纯度95%的鼠李糖脂市场价格为200～227美元/10 mg，根据不同的用途可生产不同级别的生物表面活性剂。同样在开发鼠李糖脂的国外公司还包括AGAE技术公司、Rhamnolippid公司、GlycoSurf公司和TensioGreen公司等。

国内的生物消油剂产品种类较少，大连英达石化有限公司的MD-88A产品，其主要成分是生物型表面活性剂，不含有N/P等刺激剂，也不易燃，已获得国家海事局许可并以(海船舶[2011]861号)文件的形式向全国各直属海事局予以发布；中海石油环保服务(天津)有限公司也开发出已获国家海洋局北海分局颁发的使用核准证书的生物环保消油剂。中国大庆沃太斯化工也在鼠李糖脂生物表面活性剂上持续开发，但国内未上市，仅出口北美。

目前在已发生的事故中生物消油剂已得到部分应用，Swannell等[24]在Exxon油轮溢油事故中使用生物修复剂Inipol EAP22对威廉王子湾进行了修复，达到了很好的效果，其主要成分为N/P营养盐。但营养盐的加入会加速海水的富营养化，因此近些年在使用上也被较多限制。郑立等[25]实验表明，“7.16大连溢油”事故中通过投加石油降解菌剂DC10，将石油降解效率提高了60%。 Pekdemir等[26]则使用以鼠李糖脂为代表的5种生物表面活性剂和一种化学表面活性剂的组合菌剂，用来处理Ekofisk地区的土壤石油污染，效果非常明显。

2 主要研究方向

2.1 高效石油降解菌的筛选及稳定性研究

实验室内高效石油降解菌种的筛选研发一直以来都是生物消油剂方向的热门研究，朱杰[27]从石油污染土壤中提取分离得到28株石油降解菌，发现其中能对石油降解效率达到40%以上的主要为假单胞菌属(Pseudomonas)，田永娥等[28]则从含油废水提取石油降解菌，之后进行实验室培养纯化，研究表明该菌种7 d左右的生物除油率可达到50%左右。环境因素，包括温度、营养盐、pH、溶解氧、石油烃理化性质等都将严重影响石油降解菌种的生存与繁殖，因此通过将提纯菌种的外部环境进行大量单因素变量实验，从而得到其降解石油烃的最佳环境也成为研究者的一大重要工作[29]。

随着基因工程的快速发展，石油降解菌的主要石油烃代谢基因也在不断被发现，使筛选更加高效。杨智等[30]研究了3株石油降解红球菌的主要石油烃代谢基因，主要为烷烃单加氧酶基因、芳香烃双加氧酶基因和邻苯二酚双加氧酶基因。孙敏等[31]从柴油污染海水中分离出一株高效柴油降解菌，并对其基因组进行了分析，发现扩增出了CYP-153A相关基因，并发现该种基因主要存在于能够降解中长链烷烃的菌种中，并对该基因起到的主要作用进行了探究。

稳定性研究方面，目前对于菌种保藏常见的方法是真空冷冻干燥法，但是真空冷冻干燥法会逐渐降低生物菌种的活性，超过5年之后会稳定在一个较低的活性水平。田燕等[32]基于TA 克隆分析石油微生物多样性基础上直接关注于菌种活性与冷藏时间的关系，提选出最适宜冷藏保存的菌种。

2.2 特殊环境下菌种筛选与研发

目前对本土菌种的筛选与纯化已经较为成熟，但是一般环境下提纯出的菌种遇到极端环境往往无法正常存活，生存竞争力明显下降，生长繁殖速率减慢起不到高效的石油降解作用。因此研究方向开始集中于特殊环境下的菌种筛选与条件优化，例如高原冻土区、海洋低温环境等，常见极端环境下石油降解菌种研究汇总见表2。

表2 极端环境下石油降解菌种研究Table 2 Study on petroleum degradation strains in extreme environments

青藏高原地区为季节性冻土区，常年低温，生态脆弱，王艺霖等[43]从青藏高原地区土壤中筛选出一株具有原油降解功能的细菌，低温条件下降解率可以达到71.5%。温成成等[41]则于实验室构建冻土地区环境，对机油柴油等进行土著微生物的筛选及驯化，然后进行菌群的土壤修复模拟。目前筛选出的低温降解菌，主要来自极地海洋环境。邱雪等[42]则从我国海域筛选出4株可产表面活性物质的低温石油降解菌，表面活性物质的主要种类为糖脂类，可在0 ℃左右高效降解石油。李兵等[44]则通过对辽河油田低温石油样品进行富集分离，报道出首次出现的嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，可以达到低温下10 d对石油烃类的降解达到80%以上，高于之前已知菌种的降解效率。

2.3 复合菌群构建

研究表明，同一菌种往往仅对一种或几种烃类有明显降解作用，且不同烃类的降解难度从易到难一般为：直链烷烃>支链烷烃>环烷烃>多环芳烃>杂环芳烃。由于石油产品都是成分复杂的混合物，因此复合菌群对石油产品的降解能力明显强于单一菌种。如何进行复合降解菌群的构建成为了生物修复石油污染土壤或石油废水的一大重要研究领域。王铁媛等[45]从吉林油田油水淹地污染土壤中筛选出26株石油降解菌，其中包括产表面活性剂的菌种以及石油降解菌种。通过优化筛选，最终获得10株优势菌株并构建了石油降解菌群。管亚军等[46]则复合了6个菌种组成的混合菌群用于处理油田污水，并利用气相色谱仪分析了各组成菌在降解原油中的作用和效果，挑选出关键菌株和辅助菌株。范瑞娟等[47]则从大庆油田石油污染土壤中获得6株分别具有环烷烃、直链烷烃和芳烃降解能力的菌株，菌群构建后可实现对三类烃：环十二烷、十六烷、芘的去除具有明显促进作用。

3 难点与下一步研究重点

3.1 产品级别的生物消油剂研发

关于生物消油剂方面的实验室研究从20世纪80年代就陆续开展，对于生物降解石油菌种的机理研究、种类研究、环境条件研究已非常成熟。但是产品级别的生物消油剂非常少，部分生物表面活性剂的产品应用成本非常高。可能的原因如下：①以石油降解菌为主要成分的产品在使用过程中效果较为缓慢，且环境适用性差，难以保证在污染环境下的处理效果，难以满足在事故或应急条件下投入使用并快速生效的要求；②生物表面活性剂产量低、生产成本相对较高，限制了其大规模工业化应用，市场份额小[48]；③目前国家政策对消油剂产品采取严格限制使用的政策，且消油剂产品主要用于应急事故使用，使用门槛高受众面窄，市场需求相对较小。因此如何有效提高生物表面活性剂的产量和活性、降低生产成本或寻求一种能够使石油菌种快速成活，在本土微生物系统中能够有竞争力并快速繁殖的技术，仍然是目前研究的热点。

3.2 大的示范场地的生物菌种适应性测试

目前实验室的菌种培养、富集、筛选技术已非常成熟，但是实验室的条件太为理想，无法模拟复杂的实际外环境，忽略了其他类本土微生物的强大竞争力。本土石油降解菌往往容易适应本土环境，存活率高，但是在有限资源条件下无法达到预期丰度，在出现石油碳源的情况下有很大的降解潜力，但降解速度与繁殖速度都远远低于实验室条件[49]。外源微生物则由于与本土微生物的竞争能力低下，环境的适应性差，往往在修复场地无法快速形成降解规模，单纯从实验室无法进行实际情况的有效模拟[47]。因此，对菌种的培养与适应性测试场所，应从实验室扩大到有石油污染背景的示范场地，实现企业与高校的紧密合作，将菌种适应性与土壤条件、气候条件、微生物竞争情况相综合，实现多因素考察。

3.3 复合菌群纵向构建

目前针对于石油这种复杂污染物进行菌群复合研究的较多。但是往往集中于横向复合，即组合对石油中不同组分进行降解的菌种群落构建。但是未考虑该菌群对于初步降解后产生的中间产物失去了进一步高效降解的能力，导致石油类物质无法高效降解彻底。烷烃生物降解基本可分为醇、醛、酸，最后到CO2和H2O；芳香烃则主要在加氧酶的催化下先开环形成易降解的直链烃。因此，应结合生物降解石油机理，将菌种进行纵向复合，即可对不同阶段的降解产物进行二次降解的菌种进行复合，保证石油类物质在不同降解阶段都有其对应的高效降解菌种存在，实现石油类物质彻底降解。

4 结束语

生物消油剂有其不可替代的应用场景，其无二次污染物引入、清洁高效的优点，使其成为生态修复或溢油应急的有效手段。但是目前市场上仍未有成熟的生物消油剂产品，经过文献调研与分析，以下几个方向可成为未来突破生物消油剂从实验室研究到现场广泛应用的有力推手：①生物表面活性剂的低成本高产量方向研究；②大示范场地生物消油剂应用效果研究；③复合菌群从中间产物角度的纵向复配研究。