甘西鼠尾草对高原肺动脉高压大鼠的干预作用及可能机制※

王亚峰，王爱霞，王生彪，朵德龙，严英俊，李 茜

(青海省人民医院，青海 西宁 810007)

甘西鼠尾草(Salvia przewalskii Maxim.SPM)是唇形科鼠尾草属多年生植物，又名大紫丹参和甘肃丹参，以根入药，主要分布在我国甘肃西部、四川西部、云南西北部及西藏等地，四川和云南分别将其作为秦艽和丹参的代用品使用[1-3]。HAPH是一种因高原环境缺氧，导致肺动脉压和肺血管抵抗增加，并伴随肺血管重构和血管平滑肌细胞增殖增加为特征的疾病，该疾病最终可发展为右心衰竭甚至引起死亡，其机制涉及多个方面，包括血管平滑肌细胞的增殖、氧化应激、炎症反应及离子通道的改变等[4-5]。文献报道[6]和本课题组前期所获结果都表明SPM具有明显抗急性缺氧的作用，但该药是否能防治大鼠HAPH还未定论，故本课题组以大鼠mPAP及RVHI为评价指标探究了SPM对大鼠HAPH的干预作用。另外，通过测定肺组织中介导增殖和炎症反应的相关因子(包括HIF-1α、NF-κB和MCP1mRNA)的表达水平来探究SPM发挥干预作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SD大鼠，SPF级，雄性，体重120～160 g，购自西安交通大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(陕)2017-003。

1.1.2 药品与试剂

SPM药液制备：SPM药材经洁净、干燥和粉碎等步骤后用70%的乙醇溶液超声提取；提取液经离心、干燥及研磨后得浸膏粉。临用前用蒸馏水配成混悬液。

药品和试剂：氨基甲酸乙酯(乌来糖)购自上海展云化工有限公司；肝素钠注射液购自江苏万邦生化医药集团有限责任公司；RT-PCR实验所需试剂和引物均购自TaKaRa公司(HIF-1α上游引物序列：CCAGATTCAAGATCAGCCAGCA，下游引物序列：GCTGTCCACATCAAAGCAGTACTCA；NF-κB上游引物序列：CGACGTATTGCTGTGCCTTC，下游引物序列：TTGAGATCTGCCCAGGTGGTA；MCP1上游引物序列：CTATGCAGGTCTCTGTCACGCTTC，下游引物序列：CAGCCGACTCATTGGGATCA)。

1.1.3 仪器与设备

MP150十六导生理信号采集系统购自美国BioPac公司、电子天平购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司(型号：BT 224S)、StepOnePlus Real Time PCR仪购自赛默飞公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药

大鼠随机分成5组，每组14只，分别为对照组(饲养于青海大学医学院，海拔2260m)和缺氧组及缺氧+SPM低、中、高剂量组(低、中、高剂量为0.5、1、2g·kg-1。缺氧组及缺氧+SPM低、中、高剂量组均饲养于青海省果洛州玛多县人民医院，海拔4260m)，其中低、中、高剂量分别是临床成人常用剂量的0.5、1.0、2.0倍。大鼠在相应环境下适应性喂养3 d后灌胃给药(对照组和缺氧组给予相应体质量的蒸馏水)，连续4 w，期间所有大鼠均予自由饮食(水)。

1.2.2 检测指标

4 w后参照文献[7]方法麻醉大鼠；测定mPAP；分离右心室(RV)、左心室(LV)和室间隔(S)并分别称重。通过RV/(LV+S)公式计算右心室肥大指数(RVHI)。然后取相同部位肺组织置液氮保存，采用RT-PCR法检测大鼠肺组织中的HIF-1α、NF-κB和MCP1的mRNA表达情况。

1.2.3 统计学方法

2 结果

2.1 SPM对大鼠mPAP及RVHI的影响

与对照组比较，缺氧组大鼠的mPAP和RVHI均明显升高(P<0.05)，且大鼠mPAP均大于30 mmHg，提示大鼠HAPH模型造模成功。与缺氧组比较，SPM剂量组大鼠的mPAP和RVHI均呈剂量依赖性降低，其中除低剂量组(0.5g·kg-1)的mPAP无明显降低(P>0.05)外，中剂量组(1g·kg-1)和高剂量组(2g·kg-1)的mPAP及各剂量组的RVHI均较缺氧组明显降低(P<0.05)，结果见表1。

Table 1 Levels of mPAP and

#：与对照组比较P<0.05；*：与缺氧组比较P<0.05

2.2 SPM对HIF-1α、NF-κB及MCP1mRNA表达水平的影响

与对照组比较，缺氧组大鼠肺组织中HIF-1α、NF-κB和MCP1 mRNA的表达水平均明显升高(P<0.05)；与缺氧组比较，SPM剂量组的HIF-1α、NF-κB和MCP1 mRNA表达水平均呈剂量依赖性降低，其中除低剂量组(0.5g·kg-1)的HIF-1α mRNA表达水平无明显降低外(P>0.05)，中剂量组(1g·kg-1)和高剂量组(2g·kg-1)的HIF-1α mRNA表达水平及各剂量组的NF-κB和MCP1 mRNA表达水平均较缺氧组明显降低(P<0.05)，结果见表2。

Table 2 HIF-1α、NF-κB和MCP1 mRNA expression in the lung

#：与对照组比较P<0.05；*：与缺氧组比较P<0.05

3 讨论

本实验中对照组大鼠置于青海西宁(海拔约2260m)，缺氧组和缺氧+SPM剂量组均置于青海省果洛州玛多县人民医院(海拔约4260m)，每组大鼠均在相应海拔连续处理4 w。在结果测定过程中，对照组、缺氧组、缺氧+低剂量SPM组、缺氧+中剂量SPM组分别有1、2、3、4只大鼠在采用右心导管法测定平均肺动脉压过程中因未能成功插管未得到相应数据。

根据第六届国际高原医学和生理学术大会颁布的青海诊断标准，mPAP>30 mmHg是诊断HAPH的临界指标[8]。本研究结果显示缺氧组即高原连续处理4 w大鼠的mPAP显著高于对照组(P<0.05)，且均在30 mmHg以上，说明本实验中大鼠HAPH模型造模成功。同时，结果显示SPM可剂量依赖性地降低大鼠的mPAP，且中剂量组(1g·kg-1)和高剂量组(2g·kg-1)的mPAP均较缺氧组明显降低(P<0.05)，且均降至30 mmHg以下，提示SPM可预防大鼠HAPH的发生和发展。

HAPH是一种可引起肺血管收缩、重构和肺循环功能障碍的疾病，其可造成右心室压力持续超负荷，引起进行性右心室肥大，若不能得到有效诊治，最终会发展为右心衰竭而引起死亡[9]。本研究结果显示，缺氧组和给药组大鼠的RVHI均显著高于对照组(P<0.05)，说明在高海拔环境下，持续的低压低氧引起大鼠发生HAPH的同时还导致了进行性的右心室肥大，而SPM干预组的RVHI较缺氧组明显降低(P<0.05)，且降低作用具有一定的剂量依赖性，提示SPM可明显改善大鼠HAPH诱导的右心室肥大症状，从而在一定程度上阻止HAPH的进一步发展。

此外，在高原环境下低氧是引起HAPH的主要因素，而HIF-1α作为调节低氧适应的重要核转录因子，动物实验和临床数据都表明其激活和过度表达是导致肺动脉高压发病的重要分子机制[10]。本研究结果显示，大鼠经低氧处理4 w后，HAPH大鼠肺组织中的HIF-1α mRNA表达水平较对照组明显升高(P<0.01)，提示HIF-1α处于一种过度激活和表达的状态，而SPM干预组显示出剂量依赖性地下调HIF-1α mRNA表达的作用，且中剂量组(1g·kg-1)和高剂量组(2g·kg-1)的HIF-1α mRNA表达水平较缺氧组明显降低(P<0.05)，提示SPM预防大鼠HAPA的发生可能与抑制HIF-1α mRNA过度表达有关。同时NF-κB作为重要的核转录因子，在细胞的增殖、分化和存活等过程中发挥重要作用，并对细胞因子、趋化因子、黏附分子等起关键的调控作用[11-12]，各种实验动物模型研究表明抑制NF-κB激活及其活性可明显抑制HAPH的发展[13-14]。本研究结果显示，缺氧组大鼠肺组织中NF-κB mRNA表达水平较对照组明显升高(P<0.05)，而SPM剂量组的NF-κB mRNA表达水平均较缺氧组明显降低(P<0.05)，且降低作用具有明显的剂量依赖性，提示SPM亦可能通过下调NF-κB mRNA过度表达而预防大鼠发生HAPH。另外，MCP1属于趋化因子家族，是活化和聚集单核炎症细胞至血管内皮细胞的重要介导者[15]，研究表明，其可以趋化和活化包括单核细胞、中性粒细胞以及肥大细胞等在内的多种炎性细胞，促进细胞因子产生与肺血管损伤等炎症相关的正反馈过程，从而参与肺动脉高压的发生和发展[16]。本研究结果显示，缺氧组大鼠肺组织中MCP1 mRNA的表达水平较对照组显著上调(P<0.05)，而SPM组可剂量依赖性地下调这一表达，提示SPM还可通过下调HAPH大鼠肺组织中的MCP1 mRNA表达水平来减轻炎症症状而预防其发生HAPH。

综上所述，SPM对高原环境诱导的大鼠肺动脉高压及右心室肥大具有明显的预防和改善作用，且其发挥作用的机制可能与下调HAPH大鼠肺组织中的HIF-1α、NF-κB和MCP1 mRNA过度表达有关。结合前期SPM抗急性缺氧实验结果及相关研究报道[17]即可发现，SPM在抗急慢性缺氧方面均有一定的作用，故有必要对其在防治急慢性高原病方面的作用进行挖掘性研究。同时，其发挥抗缺氧作用的确切物质基础及作用机制尚不明确，还需进行大量的研究工作。

(致谢：感谢青海省果洛州玛多县人民医院、青海大学医学院高原医学研究中心在本研究中所给予的大力支持和帮助！)