miR-138 在类风湿关节炎患者外周血中的表达及其与Th1/Th2 的关系

吴玮玮，卜殷中

（1.宁波市鄞州区第二医院，浙江 宁波315192；2.上海市普陀区人民医院，上海200060）

类风湿性关节炎（rheumatic arthritis，RA）是一种常见的结缔组织炎症，与自身免疫异常有关[1]。 以关节、肌肉游走性酸痛、红肿为主要特征，易受阴冷、潮湿等环境因素的影响[2]。miR-138 可靶向调控多种与自身免疫性疾病发生发展密切相关的基因，参与疾病的进展[3]，Th1/Th2 失衡与类风湿性关节炎的发生发展密切相关[4]，但在类风湿性关节炎中，miR-138与Th1/Th2 的关系尚不清楚。 本研究主要通过观察RA 患者及健康者外周血血清miR-138 的表达情况，分析其与Th1/Th2 平衡的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 根据诊断分类标准[5]，选择2017年9月-2018 年9月宁波市鄞州区第二医院收治的RA 活动期患者41 例，RA 稳定期患者34 例，另选取同期体检健康者30 例作为对照组。 三组性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 三组一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 标本的采集与处理 所有研究对象晨起空腹抽取肘静脉血5mL，分成两管，其中一管-80℃保存；另一管3000r/min、-4℃冷冻离心10 分钟，分离的上清液-80℃保存。

1.2.2 血清miR-138 的检测 采用qRT-PCR 法检测所有研究对象外周血血清中miR-138 相对表达量。 按照Trizol 试剂盒说明书操作提取血清总RNA， 按照miRNA 反转录试剂盒操作步骤将2μgRNA 反转录为cDNA， 之后按照SYBR Green RCR master mix 试剂说明配反应体系并加样。qRT-PCR 反应 体 系共为20μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10μL，cDNA 2.0μL，上下游引物各0.8μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4μL，ddH2O 6.0μL。完成后将其放入荧光定量PCR 仪上反应， 程序设定为：95℃预处理30 秒，95℃15 秒，60℃15 秒，72℃15 秒。 上述三个步骤循环40 次，72℃终延伸10 分钟。 miR-138 以U6 为内参，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物设计见表1。反应结束后收集数据，并对所得数据CT 值进行分析，采用2-ΔΔCT算法计算miR-138 的相对表达量。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.2.3 外周血CD4+细胞Th1、Th2 细胞检测 采用流式细胞中检测外周血CD4+细胞Th1、Th2 细胞比例。 取1.2.1 中全血标本100μL 置于流式管中，三组均加入藻红蛋白（PE）/异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鼠抗人Cy5-CD4 单克隆抗体以及抗CD4单抗-Cy5 各20μL， 以CD4+IFN-γ+IL-4-代表Th1细胞亚群， 以CD4+IFN-γ-IL-4+代表Th2 细胞亚群。 涡旋振荡器混匀，于室温下避光反应15 分钟，加入溶血素1mL 室温避光20 分钟，加入PBS 缓冲液2mL，离心，弃上清液，加入1%多聚甲醛500μL重悬细胞，上机检测CD4+Th1 与CD4+Th2，并计算Th1/Th2。上机检测时首先按照前向散射（FSC）和侧向角散射（SSC）光信号予淋巴细胞群设门，每份检测标本获取设门内10000 个细胞，检测后所得数据以Listmode 文件形式保存。

1.2.4 细胞因子检测 取1.2.1 中血清标本冰上解冻，恢复室温后采用IL-2 ELISA 试剂盒（上海钰博生物科技有限公司）、IFN-γ ELISA 试剂盒（上海齐一生物科技有限公司）、TNF-α ELISA 试剂盒 （上海齐一生物科技有限公司）、IL-4 ELISA 试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）、IL-10 ELISA 试剂盒 （上海康朗生物科技有限公司） 检测IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10 水平。 操作严格参照说明书进行。

1.3 统计学处理 采用统计学软件SPSS17.0 进行数据分析，计量资料符合正态分布的数据均以（±s）表示，多组间行方差分析，两组间比较采用SNK-q检验；使用Pearson 法进行相关性分析。

2 结果

2.1 miR-138 表达及Th1、Th2 细胞比例 三组miR-138 表达及Th1、Th2 细胞比例、Th1/Th2 差异均有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，RA 稳定期组miR-138、Th1 细胞比例显著升高， 差异有统计学意义（P＜0.05），Th2 细胞比例、Th1/Th2 细胞比例差异无统计学意义（P＞0.05），RA 活动期组Th1、Th2 细胞比例、Th1/Th2 均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与RA 稳定期组相比，RA 活动期组miR-138、Th1、Th2 细胞比例、Th1/Th2 显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。 详见表2。

表2 三组miR-138、Th1 细胞、Th2 细胞比例及Th1/Th2 比较（±s）

表2 三组miR-138、Th1 细胞、Th2 细胞比例及Th1/Th2 比较（±s）

与对照组比较*P＜0.05；与RA 稳定期组比较#P＜0.05

组别 n miR-138 Th1（%） Th2（%） Th1/Th2对照组 301.02±0.188.62±1.432.35±0.293.01±0.72 RA 稳定期组 341.31±0.21* 10.91±1.38* 2.41±0.313.32±0.93 RA 活动期组 411.94±0.26*# 13.58±2.26*# 4.31±1.27*# 3.66±1.01*#F 值 — 160.047 67.767 67.609 4.483 P 值 — 0.000 0.000 0.000 0.014

2.2 Th1、Th2 细胞相关因子 三组各细胞因子比较差异均有统计学意义（P＜0.01），两两比较，与对照组相比，RA 稳定期组和RA 活动期组IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IFN-γ/IL-4 水平均显著升高， 差异有统计学意义（P＜0.05）；与RA 稳定期组比较，RA 活动 期 组IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IFN-γ/IL-4 水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表3。

表3 三组细胞因子水平比较（±s）

表3 三组细胞因子水平比较（±s）

与对照组比较*P＜0.05；与RA 稳定期组比较#P＜0.05

组别 n IL-2（ng/mL） IFN-γ（pg/mL） TNF-α（pg/mL） IL-4（pg/mL） IL-10（pg/mL） IFN-γ/IL-4对照组 30 1.93±0.18 18.46±4.42 12.11±2.01 1.97±0.42 8.25±1.65 9.37±1.43 RA 稳定期组 34 2.21±0.21* 32.14±8.16* 12.14±2.14 3.18±0.73* 9.27±5.34* 10.10±1.79 RA 活动期组 41 4.62±1.03*# 78.88±10.19*# 17.27±2.61*# 5.92±1.10*# 19.69±3.92*# 13.32±2.16*#F 值 185.017 544.525 62.366 212.795 72.543 47.221 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 相关性分析 Pearson 相关性分析显示， 外周血血清miR-138 表达与Th1 细胞比例、Th2 细胞比例、Th1/Th2、IFN-γ/IL-4 均呈正相关（r=0.531、0.612、0.526、0.578，P＜0.05）。

3 讨论

RA是一种常见自身免疫性疾病， 以滑膜炎为主，发病机制未阐明，可能与遗传、感染、性激素紊乱等有关。早期免疫病理学研究表明，RA 滑膜组织中细胞呈弥漫式浸润，其中Th1/Th2 失衡与类风湿性关节炎的发生发展密切相关[6]。 miRNA 是机体非编码微小RNA， 可通过调节靶基因的转录及翻译调控靶基因的蛋白表达。miR-138 可参与多种恶性肿瘤的发生发展[7-9]与红斑狼疮的发病[3]。 近来有研究表明，miRNAs 在自身免疫性疾病中发挥着重要作用[10]。 Zhang 等[11]研究表明，miR-138 在类风湿性关节炎患者血清内高表达。 本研究中qRTPCR 法显示，RA 患者血清miR-138 明显上调，且RA 活动期患者血清miR-138 显著高于稳定期患者，提示高水平的血清miR-138 可能与RA 的发生发展密切相关，miR-138 表达上调可能与RA 患者免疫功能异常、炎症反应存在一定关系。

Th细胞间的平衡状态与多种疾病的发生发展密切相关，Th1 细胞主要介导细胞免疫应答， 主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α 等细胞因子，促进细胞毒T 细胞的杀伤作用[12]。Th2 介导体液免疫，分泌IL-4、IL-10 等细胞因子，抑制细胞免疫应答，使Th1、Th2处于免疫平衡状态[13]。Papadaki 等[14]研究表明，自身反应性Th1 通过持续诱导免疫应答，使滑膜始终处于炎症状态，最终导致关节软骨的破坏。本研究中，RA 患者外周血CD4+细胞中Th1 细胞比例、Th2 细胞比例均显著升高， 与Th1 细胞相比，Th2 细胞增长幅度较少，因此Th1/Th2 比例升高。 同时Th1 相关细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α 以及Th2 相关细胞因子IL-4、IL-10 水平显著升高， 提示RA 患者存在复杂的炎症反应，促炎因子与抑炎因子均大量产生。此外，IFN-γ/IL-4 比例显著升高，提示RA 患者Th1/Th2 失衡，呈Th1 优势。 Fu 等[15]研究表明，miR-138 可靶向调控银屑病RUNX3 来调节Th1/Th2 平衡。Qiu 等[16]研究表明，miR-138 与miR-371、miR-544、miR-145 的组合可调控RUNX3 基因表达调节哮喘患者的Th1/Th2 平衡。 本文结果显示，外周血血清miR-138 与Th1 细胞比例、Th2 细胞比例以及Th1/Th2、IFN-γ/IL-4 呈正相关， 推测miR-138 可能通过影响Th1/Th2 平衡参与类风湿性关节炎发生发展。

综上所述，RA 患者外周血血清中miR-138 高表达，外周血血清Th1/Th2 失衡，呈Th1 优势，miR-138可能通过影响Th1/Th2 平衡参与RA 过程。