酒炖白芷中总香豆素及4种香豆素类成分的含量测定

朱春璐 王静 乔宇航 谢鑫荣 袁子民

【摘 要】目的：建立酒炖白芷中总香豆素及4种香豆素成分的含量测定方法，并比较炮制对其含量的影响。方法：总香豆素的测定采用紫外分光光度法，以欧前胡素为对照品，测定波长为300 nm;4种香豆素类成分含量采用HPLC法，色谱柱为（4.6 mm×250 mm，5 μm）为迪玛C18，以甲醇-水（70∶30）为流动相，检测波长300 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃。结果：总香豆素测定中欧前胡素在1.92～19.20 μg·mL-1内呈良好线性关系，平均加样回收率为97.2%，RSD=1.3%;4种香豆素类成分测定中氧化前胡素、欧前胡素、8-甲氧基异欧前胡内酯及异欧前胡素分别在0.013～0.26 μg、0.016～0.32 μg、0.0082～0.164 μg、0.0085～0.17 μg内线性关系良好，平均加样回收率在97.0%～99.2%，RSD<2.20%。结论：所建立的方法简单、准确、重复性好，可用于酒炖白芷的含量测定。

【关键词】酒炖白芷;总香豆素;氧化前胡素;欧前胡素;8-甲氧基异欧前胡内酯;异欧前胡素

【中图分类号】R248.1 【文献标志码】A 【文章编号】1007-8517（2019）19-0027-03

Abstract：Objective To estabish the methods for determining total coumarins and four coumarin constituents in Angelicae dahuricae Radix processed with yellow rice wine， and then compare the processing effect on the contents of these compounds. Methods Total coumarins were determined by UV， an UV method was developed at 300 nm， using imperatorin as a reference substance. Four coumarin constituents were determined by HPLC，the column named Diamonsil C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used for the chromatographic separation. Methanol-Water（70∶30）was determined as the mobile phase. The flow-rate was set to 1.0 mL·min-1;The detection wavelength was set at 300 nm. The column temperature was fixed at 30 ℃. Results The linear range of imperatorin was 1.92 ～ 19.20 μg·mL-1， and the average recovery was 97.2% and the relative standard deviation （RSD） was 1.3% in the determination of total coumarin. The linear relationships of Oxypeucedanin， imperatorin， cnidilin and isoimperatorin were good in the range of 0.013～0.26 μg， 0.016～0.32 μg， 0.0082～0.166 μg and 0.0085～0.17 μg， respectively. The average recovery was 97.0% and 99.2%， and the RSD was less than 2.20%. Conclusions The methods were simple， accurate and reproducible， and could be used for the determination of these compounds in the Angelicae dahuricae Radix processed with yellow rice wine.

Key words：Angelicae dahuricae Radix processed with yellow rice wine;total coumarins;oxypeucedanin; imperatorin;cnidilin;isoimperatorin

白芷具有解表散寒，祛风止痛等功效。古代白芷的炮制品有醋炒、酒炒、酒浸、蒸制、酒蒸等多种炮制方法，其酒制后可增强白芷祛风散寒、消肿排脓作用[1]。都梁丸收载于2015版《中国药典》，用于风寒瘀血阻滞脉络所致的头痛，该方君药为酒炖白芷[2]，其炮制目的及对药效成分的影响研究甚少，文献报道[3-6]白芷中总香豆素、氧化前胡素、欧前胡素、8-甲氧基异欧前胡内酯及异欧前胡素具有抗炎、镇痛、解痉等药理作用。因此，本文建立了酒炖白芷中总香豆素及4种香豆素含量测定方法，并比较酒炖前后对其药效成分的影响，为其质量标准的建立及炮制机理的深入研究提供科学依据。

1 仪器与试药

U-3010紫外可见分光光度计（日本日立公司）; Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）;KQ3200超聲波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。白芷三批（祁白芷，河北安国），经辽宁中医药大学李峰教授鉴定为伞形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.的干燥根;氧化前胡素、8-甲氧基异欧前胡内酯、欧前胡素、异欧前胡素对照品均购于上海源叶生物科技有限公司，HPLC检测纯度均≥98%;甲醇为色谱纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 酒炖白芷的制备 取药材除去杂质，大小分开，略浸，润透，切厚片，干燥，得白芷饮片。取白芷饮片，加入黄酒（每100 Kg白芷加入黄酒20 Kg），闷润时间为0.5 h，隔水蒸制时间为5 h，干燥，即得。

2.2 总香豆素的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 取欧前胡素对照品适量，精密称定，加甲醇制成19.2 μg·mL-1对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 分别取白芷、酒炖白芷粉末（过20目筛）约0.2 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率300 W，频率50 KHz）1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

2.2.3 线性关系考察 分别精密量取2.2.1项下的对照品溶液1.0、2.0、4.0、5.0、10.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成系列浓度对照品溶液，以甲醇为空白，在300 nm波长处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y=0.0443x+0.0096（r=0.9994）。结果欧前胡素浓度在1.92～19.20 μg·mL-1内线性良好。

2.2.4 精密度試验 取同一供试品溶液，以甲醇为空白，在300 nm波长处测定吸光度，重复6次，结果RSD为1.02%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验 取同一酒炖白芷饮片样品，按2.2.2项下方法分别制备6份供试品溶液，以甲醇为空白，分别在300 nm波长处测定吸光度，计算含量，结果平均含量为1.58%，RSD为1.8%，表明该方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一酒炖供试品溶液，分别于0，2，4，6，8 h以甲醇为空白，在300 nm波长处测定吸光度，结果RSD为1.25%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.2.7 回收率试验 分别取已知含量的同一酒炖白芷饮片粉末（总香豆素含量为1.60%）0.1 g，精密称定，各6份，分别精密加入欧前胡素对照品溶液（浓度为192 μg·mL-1）8.0 mL，再精密加入甲醇17.0 mL，其余按“2.2.2”项下方法分别制备6份供试品溶液。依法测定，计算回收率，结果回收率在96.2%～99.4%之间，平均回收率为97.2%，RSD为1.3%，符合相关规定。

2.2.8 样品含量测定 取3批白芷及其炮制的酒炖白芷样品，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，依法测定，计算含量。结果见表2。

2.3 4种香豆素的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：甲醇-水（70∶30）;流速：1.0 mL·min-1;检测波长：300 nm;柱温：30 ℃;进样量：10 μL。色谱图见图1。

2.3.2 混合对照品溶液的制备 分别取4种香豆素对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1 mL含欧前胡素0.8 mg、8-甲氧基异欧前胡内酯0.82 mg、异欧前胡素0.85 mg、氧化前胡素0.65 mg的对照品溶液备用。分别精密量取欧前胡素、氧化前胡素对照品溶液各2.0 mL及8-甲氧基异欧前胡内酯、异欧前胡素对品溶液各1.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 供试品溶液制备 分别取白芷、酒炖白芷粉末（过20目筛）约0.2 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率300 W，频率50 KHz）1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，分别取续滤液作为供试品溶液。

2.3.4 线性关系考察 分别精密量取上述“2.3.2”项下的混合对照品溶液0.10、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密量取10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。结果见表1，各成分线性关系良好。

2.3.5 精密度试验 取同一酒炖供试品溶液，在上述色谱条件下，连续进样6次，记录峰面积并计算RSD，结果4种香豆素峰面积的RSD分别为1.4%、1.6%、1.8%、1.3%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 分别精密吸取同一酒炖供试品溶液，分别在0、2、4、6、8 h，测定峰面积并计算RSD，结果4种香豆素峰面积的RSD分别为1.3%、1.5%、1.8%、1.9%，表明8 h内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 取同一酒炖样品各6份，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，并依法测定并计算RSD，结果4种香豆素含量的RSD分别为1.2%、1.6%、1.4%、1.7%，表明重复性良好。

2.3.8 回收率试验 精密称取已知含量的酒炖白芷粉末约0.1 g，精密称定，平行6份，分别按样品含量加入4种香豆素对照品溶液适量，按2.3.3项下制备供试品溶液，测定含量，结果4种香豆素的平均回收率分别为98.4%、99.2%、97.0%、97.2%，RSD分别为1.8%、1.7%、2.3%、2.3%，表明回收率试验良好，符合有关规定。

2.3.9 样品含量测定 取3批白芷及其炮制的酒炖白芷，按2.3.3项下的方法制备供试品溶液，依法测定，计算含量。结果见表2。

3 讨论

将4种香豆素类对照品溶液、供试品溶液分别在200～400 nm進行扫描，结果均在300 nm处有最大吸收，因此选择300 nm作为总香豆素及4种香豆素类成分含量测定的波长。本实验采用等度洗脱，4种香豆素类成分均能达到较好的分离，便于测定。

有文献研究表明川白芷样品熏硫前后多种香豆素类成分的含量有较大损失[7]，表明香豆素类成分稳定性较差。本实验研究发现酒炖（隔水蒸制）炮制后总香豆素含量增加，但4种香豆素类成分含量均有所下降，可能与黄酒的弱酸性、受热及蒸汽中水的作用下使成分转化有关[8-9];但总香豆素含量增加，可能与新的香豆素类成分的产生及转化成其他成分后紫外吸收增强有关;另外，由于成分含量的变化，可能对药效作用产生改变，这与都梁丸中白芷采用酒炖炮制后入药，增强治疗偏头痛药效是否一致，还需进一步深入研究。

参考文献

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（收稿日期：2019-07-09 编辑：刘斌）