黑炭/零价铁复合材料耦合金属还原菌对溶液中Cr(Ⅵ)的去除

王维大，李硕，林薇，李玉梅，张连科，韩剑宏

内蒙古科技大学能源与环境学院，内蒙古 包头 014010

铬是冶金、电镀、印染、木材防腐及皮革制造等行业的重要原料，在其工业生产过程中，大量含铬废水被排入周边环境中，对水体及土壤造成严重污染（Yong et al.，2011）。在环境中，铬的形态主要以 Cr(Ⅲ)和 Cr(Ⅵ)为主，Cr(Ⅵ)的迁移性和毒性强，且具有潜在的致畸和致突变作用（秦泽敏等，2016），而Cr(Ⅲ)毒性较低，在碱性条件下易形成氢氧化铬沉淀，因此，在修复Cr(Ⅵ)的污染方法中往往先将 Cr(Ⅵ)还原为 Cr(Ⅲ)。

目前，水体中Cr(Ⅵ)的还原方法主要有铁还原法、电化学还原法及微生物还原法（汤洁等，2013）。铁还原和微生物还原处理含铬废水是目前研究的热点，其中零价铁是一种标准电位为-0.44 V的强还原剂，因其具有较强表面反应活性和相对较低的价格，被广泛应用于地下水中及土壤的重金属的修复（Yang et al.，2017）。纳米零价铁颗粒容易产生团聚、沉淀的现象，导致与污染物的接触面积减少，难以实际应用。同时，粒径较大的零价铁颗粒表面易被空气氧化，表面形成钝化层，造成反应后期去除率降低。金属还原菌是一类以金属离子为末端电子受体进行无氧呼吸的菌株。该无氧呼吸过程偶联着有机或无机电子供体的氧化，可释放能量，支持微生物生长。由于Fe(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的地球化学丰度比较高，在自然界中只要有厌氧环境，几乎都会发生异化Fe(Ⅲ)与Cr(Ⅵ)的还原现象。已报道的具有还原 Fe(Ⅲ)和 Cr(Ⅵ)能力的菌株有 Bacillus cereus、Pseudomonas sp.、 Acinetobacter sp.、 Shewanella oneidensis、Escherichia coli等（Sathishkumar et al.，2016；Tang et al.，2010）。但微生物还原存在周期长、易受重金属抑制等缺点。为了提高微生物对Cr(Ⅵ)的耐受性和还原效果，往往通过将菌株固定化来提高其对Cr(Ⅵ)的耐受性，通过添加电子供体和电子穿梭体等物质，来增加微生物调控重金属离子价态的速度和效果。研究表明，高度多孔性和较高比表面积的生物质炭可以作为微生物的载体，而铁离子可以作为电子穿梭体，增加微生物代谢过程中的电子转移，提高重金属的还原效果。目前，有关以碳材料为载体，固定化微生物及负载零价铁的研究已数见不鲜，而将三者融为一体、互存互促、构成耦合循环体系的研究报道较少。

本研究通过将黑炭/零价铁复合材料与金属还原菌进行耦合，建立高效稳定的耦合体系，考察耦合体系中Cr(VI)的去除效果及影响因素，并研究了耦合体系中铁的动态变化，以期实现耦合体系还原-吸附一体化去除溶液中的Cr(VI)，为环境中Cr(VI)污染的修复奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 培养基

菌株所用液体培养基为LB培养基（蛋白胨10 g·L-1，酵母 5 g·L-1，氯化钠 10 g·L-1)，用 NaOH 和HCl调节pH值为7.0，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。固体培养基是在液体培养基中按每升溶液加入15 g的琼脂获得。将一定量过滤除菌后的重铬酸钾溶液注入LB培养基中获得含Cr(Ⅵ)培养基。

1.1.2 铬还原菌的筛选及鉴定

称取1 g包头市韩庆坝原铬渣场周边土壤样品于已灭菌的100 mL生理盐水中，采用10倍稀释法将其稀释后涂布在含Cr(Ⅵ)固体培养基上，在37 ℃下恒温培养24 h后，观察单菌落特征，之后挑选不同形态特征的菌落进行分离纯化，得到具有抗Cr(Ⅵ)能力的菌株。通过考察抗Cr(Ⅵ)菌株对Cr(Ⅵ)的还原能力，选择最优的菌株作为后续研究所用的铬还原菌，对其进行16S rDNA基因的测序分析，将测得的细菌序列通过Blast在GenBank中进行相似性检索，并构建其菌种发育树。

1.1.3 黑炭/零价铁复合材料的制备

将玉米秸秆洗净、自然晾干后，对其进行粉碎得到供试秸秆粉末。称取40 g FeCl3·6H2O，溶于60 mL去离子水中，加入15 g供试秸秆粉末，采用搅拌器将其混合均匀后进行抽滤，滤渣于 80 ℃恒温干燥箱干燥，干燥后的样品放入刚玉坩埚中，置于管式炉中氮气氛围下以 10 ℃·min-1的升温速率加热至900 ℃，恒温热解2 h后，自然冷却至室温，即得黑炭/零价铁复合材料。

1.2 实验方法

取 100 mL含 Cr(Ⅵ)液体培养基，用 HCl和NaOH调节溶液pH值至相应值后加入0.1 g黑炭负载零价铁材料。取培养24 h左右（OD600为1.2—1.6）的铬还原菌培养液3mL接种至上述培养基中，放入振荡器中在100 r·min-1转速下振荡培养，定期取出混合培养液进行Cr(VI)浓度和蛋白质含量的测定，计算 Cr(VI)去除率。实验过程中考察不同初始Cr(VI)质量浓度（100—400 mg·L-1）和不同 pH 值（4.0—9.0）的影响。所有实验均设 3个平行样。Cr(VI)的去除率：

R为Cr(Ⅵ)的去除率；ρ0为初始溶液中Cr(VI)质量浓度（mg·L-1）；ρt为t时刻溶液中 Cr(VI)质量浓度（mg·L-1）。

1.3 分析测试方法

采用二苯碳酰二肼分光光度法（GB 7467-87）于540 nm波长处测定六价铬浓度；采用邻菲罗啉分光光度法于510 nm波长处测定Fe(Ⅱ)含量；采用火焰原子吸收法测定样品中总铬、总铁含量；采用 Bardford法测定体系中蛋白质含量（李娟等，2000）；采用RTS-9型双电测四探针法测量样品的电导率；采用日立S-3400N型扫描电镜（SEM）观察样品的形貌特征；采用ESCALAB 250型X射线光电子能谱分析仪（XPS）对样品表面的元素组成和原子价态等进行定性分析。

2 结果与讨论

2.1 铬还原菌及其性能分析

将所筛选出Cr(VI)还原性能最优的菌株命名为GY-1。以27F、1492R为引物进行PCR扩增，并测定了其序列，经16S rDNA基因测序及同源性比较，结果显示该菌株的16S rDNA基因序列与Bacillussp.序列的相似性达到100%，因此，确定菌株GY-1为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。根据GY-1菌的16S rDNA序列与相关属种序列构建系统发育树如图1所示。图2为菌株GY-1对Cr(VI)和Fe(III)还原能力的测定结果，由图 2a可以看出，随着反应时间的延长，溶液中Fe(Ⅱ)的含量逐渐在增加，100 h后二价铁的含量为16.8 mg·L-1。由图2b可知，当溶液中Cr(VI)质量浓度为100 mg·L-1时，在反应过程中 Cr(VI)呈下降趋势，Cr(III)呈上升趋势，在48 h后Cr(VI)去除率为97.51%。结合图2a和图2b所得结果，说明菌株GY-1同时具备还原Fe (III)和Cr(VI)的能力，这与Shafique et al.（2016）和权海荣等（2016）的研究结果已一致。

图1 菌GY-1的16S rDNA系统发育树Fig. 1 16S rDNA phylogenetic tree of the strain GY-1

图2 菌GY-1对Fe(III)和Cr(Ⅵ)的还原性能Fig. 2 Reduction performance of the strain GY-1 for Fe (III) and Cr (VI)

2.2 黑炭/零价铁复合材料与菌GY-1耦合前后的SEM分析

由图 3a可知，零价铁颗粒较为均匀的镶嵌到黑炭的表面孔隙中，形成黑炭/零价铁复合材料。比表面积分析结果显示，其比表面积为385.32 m2·g-1，孔径、孔容积分别为4.37 nm、0.44 cm3·g-1，该条件为微生物的附着生长提供有利条件，同时也增加了材料与污染物的接触面积（Vilar et al.，2007）。由 3b可知，菌 GY-1与黑炭/零价铁复合材料结合紧密，说明黑炭/零价铁复合材料作为一种载体材料，可较好地固定微生物菌株，为其生长提供适宜的微环境，以致其活性提高。同时黑炭/零价铁复合材料的电阻率为 4.03 Ω·cm，具有良好的导电性，可以强化电子的远程传递（Liu et al.，2012），加快对Cr(Ⅵ)的还原速率。对比反应前（c）和反应后（d）菌体形态可知，反应前复合材料表面附着的菌体长约1.5—3 μm，反应完成后，菌株个体长度变短，约1—2 μm，这可能是因为高浓度Cr(Ⅵ)对菌体产生胁迫作用所致。

图3 黑炭/零价铁复合材料及其与菌GY-1耦合反应前后的SEM图Fig. 3 SEM image of chromium-reducing bacteria-biochar-loaded zero-valent iron coupling system before and after reaction

2.3 对比实验

在pH为6，Cr(VI)初始质量浓度为100 mg·L-1条件下，分别对比了黑炭/零价铁复合材料、菌GY-1以及黑炭/零价铁复合材料耦合菌GY-1对六价铬的还原性能，所得结果如图4所示。由图可知，耦合体系中Cr(Ⅵ)去除率最高为99.83%，明显优于单独使用黑炭/零价铁复合材料和单独使用菌GY-1的效果，其原因主要为黑炭/零价铁复合材料在偏中性条件下铁碳微电解反应速率较慢，对Cr(Ⅵ)的还原去除效果较差，而单一菌株容易受Cr(Ⅵ)的胁迫，从而对其活性产生一定的抑制作用，相比于游离微生物，被固定化的铬还原菌处于高度密集状态，微生物的稳定性、抗毒性增强（李杰等，2008）。而耦合体系中，菌GY-1被固定后提高其对Cr(Ⅵ)胁迫作用的同时，生物炭表面的零价铁也对Cr(Ⅵ)具有较好的还原效果，因此，二者耦合可实现优势互补，使Cr(Ⅵ)的去除率提高。

图4 单因素和耦合体系分别对Cr(Ⅵ)去除的影响Fig. 4 Effect of single factor and coupling system on Cr(VI) removal

2.3.1 不同六价铬初始浓度对耦合体系Cr(Ⅵ)去除的影响

本实验考察了pH为6，Cr(Ⅵ)质量浓度分别为100、200、400 mg·L-1的条件下，耦合体系对 Cr(Ⅵ)的还原效果以及对铬还原菌活性的影响，所得结果如图5所示。

从图5a可以看出，Cr(Ⅵ)初始质量浓度为100 mg·L-1条件下，耦合体系在24 h左右基本将溶液中Cr(Ⅵ)全部去除。在初始质量浓度为200 mg·L-1和400 mg·L-1条件下，耦合体系去除效果明显变差，96 h后Cr(Ⅵ)的去除率分别为74.92%和33.06%，说明Cr(Ⅵ)浓度越高，对微生物的生长抑制作用越强。反应48 h后测定耦合体系中蛋白质含量，所得结果如图5b所示。由图5b可知，Cr(Ⅵ)浓度越高，反应体系中蛋白质浓度越低，说明微生物菌体的数量越少，其原因主要为高浓度的Cr(Ⅵ)对细菌产生了一定的毒性，使得细菌生长明显受到抑制，影响其对Cr(Ⅵ)去除效果。

2.3.2 不同溶液 pH 对耦合体系中 Cr(Ⅵ)的还原效果

微生物所处环境的 pH值对其生长代谢活性影响较大，pH通过影响细胞质膜的通透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响微生物的代谢活力（李杰等，2008）。本实验考察了耦合体系初始 pH值范围为 4.0—9.0对Cr(Ⅵ)的去除效果，所得结果如图6所示。

由图6a可知，在反应初始阶段，pH值为4的条件下去除效率最高，此时主要为黑炭负载零价铁的作用效果，即零价铁对Cr(Ⅵ)的还原或生物炭的吸附作用。在酸性条件下，黑炭负载零价铁作用效果明显。由式（2）、式（3）可知，

图5 不同初始质量浓度下耦合体系Cr(VI)去除率和蛋白质含量Fig. 5 Cr(VI) removal rate and protein content of the coupling system at different initial concentrations

图6 不同初始pH值下耦合体系Cr(VI)去除率和蛋白质含量Fig. 6 Cr(VI) removal rate and protein content of the coupling system at different initial pH values

H+参与反应并且会被消耗，H+可以促进Fe0与Cr(Ⅵ)的反应。结合图6b可知，在pH值为4的条件下，蛋白质含量最少，说明在该条件下，Cr(Ⅵ)对铬还原菌产生了毒性，其生长受到抑制。随着反应的进行，铬还原菌的不断生长，在初始pH值为7的条件下，Cr(Ⅵ)去除效果最好，在24 h时去除率便可以达到95.86%。在48 h时，相比于其他pH值条件下，蛋白质的质量浓度最高，达到 183.77 mg·L-1。在整个培养过程中，随着时间的增加，在初始pH值为6的条件下，耦合体系也表现出了较好的去除效果，在 48 h时，Cr(Ⅵ)去除率达到99.03%。虽然细菌在初始pH值为6的条件下蛋白质含量低于初始pH值为7的条件下，但是两者最终的去除率相近，这可能是因为细菌的还原酶在该条件下对Cr((Ⅵ)具有较好的还原效果。另外，在初始pH值为9的条件下，耦合体系前期对Cr(Ⅵ)去除效果较差，随着铬还原菌对环境的不断适应，反应 48h后蛋白质含量为 106.77 mg·L-1，且后期Cr(Ⅵ)的去除率有所提高，最高达89.55%。不难看出，溶液的pH值不但会影响细菌的生长繁殖，而且会对耦合体系去除溶液中的Cr(VI)产生影响。

图7 C(VI)去除过程中pH值的变化Fig. 7 Change in pH during removal of C(VI)

在该实验过程中，对体系中pH值变化情况进行了监测，结果如图7所示。在初始值为4和5的条件下，经过48 h，整个培养过程中体系pH值升高1左右，但仍为酸性环境。这可能由于零价铁在酸性环境下腐蚀速率加快，体系中OH-离子大幅度增加，所以pH出现升高的现象。在初始pH值为6、7和8的条件下，6 h时pH值均在7左右，48 h后均趋于8。初始pH值为9时，6 h后pH稍有下降，但经过48 h后，pH也趋于8。这可能与细菌在生长过程中的分泌物质有关，能够自主的调节溶液中pH值，同时，体系中pH值的改变也说明了细菌对环境具有适应能力。另外，由于耦合体系中黑炭负载零价铁的存在，对菌株起到了一定的保护作用，有助于缓冲外界pH值对铬还原菌的影响。

2.4 耦合体系铁的动态变化

本实验在初始Cr(Ⅵ)质量浓度为100 mg·L-1，pH值为 6的条件下，以单独黑炭负载零价铁组作为对比，测定Fe(Ⅱ)及总Fe的浓度变化，所得结果如图8所示。

图8 Cr(VI)去除过程中铁的质量浓度变化Fig. 8 Variation of iron concentration during Cr(VI) removal

由图8可知，反应过程中的铁离子主要由溶出的为Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)组成。6 h时耦合体系与黑炭负载零价铁中Fe(Ⅱ)和总Fe的含量相差不大。随着时间的变化，菌体数量增加，耦合体系Fe(Ⅱ)的含量逐渐增加，且明显多于黑炭/零价铁复合材料组。24 h时耦合体系中Fe(Ⅱ)的含量达到最大，约为18.16 mg·L-1，此时 Cr(VI)的去除率已达到 95.47%（图 5），黑炭/零价铁复合材料中 Fe(II)的含量约为 11.46 mg·L-1，说明铬还原菌可能将零价铁表面钝化层的Fe(Ⅲ)还原为 Fe(Ⅱ)，Fe(Ⅱ)继续参与还原反应，还原产物 Cr(Ⅲ)最终以铁铬氧化物的形式沉淀下来。随着时间的延长，黑炭负载零价铁中总Fe的含量相对稳定，而耦合体系中总Fe的含量开始有所下降，说明菌体不但具有Fe还原能力，而且会吸附溶液中的铁离子，导致总Fe的含量降低。黑炭负载零价铁与铬还原菌相耦合，一方面，黑炭负载零价铁可作为菌株生长繁殖的场所；另一方面，微生物能还原零价铁钝化层的 Fe(Ⅲ)为 Fe(Ⅱ)，生成的 Fe(Ⅱ)既能参与还原 Cr(VI)，产生循环效果。此外，铁离子可以作为一种电子传递介质增强零价铁与 Cr(VI)之间的电子传输，加速反应的进行，解决零价铁钝化层问题（2018），增强协同体系去除Cr(VI)的效果。

2.5 耦合体系XPS分析

图9 反应前后耦合体系的全谱分析（a、b）及反应后Fe(2p)和Cr(2p)的（c和d）XPS谱图Fig. 9 Full spectrum analysis of the coupled system before and after the reaction (a， b) and the (c and d) XPS spectra of Fe(2p) and Cr(2p) after the reaction

为了进一步说明黑炭/零价铁复合材料与金属还原菌耦合体系对Cr(Ⅵ)的去除机理，待反应进行48 h后，采用XPS对去除Cr(Ⅵ)前后的材料进行表征分析，分峰拟合后，如图9所示。耦合体系的全谱图中，明显出现了C1s、O1s、N1s和Fe 2p轨道的特征峰。在反应前，这些元素的结合能大约C1s 284.45 eV，N1s 402.08 eV，O1s 532.29 eV，Fe2p 711.20 eV，在与 Cr(VI)反应 48h后，在 Cr2p 577.24eV很明显出现了一个新的峰值，证明了耦合体系中产生了铬的积累。图（c）为耦合体系的Fe(2p)XPS谱图，在709.83、711.19、713.29、717.95、723.84、726.88 eV处对应Fe (2p 3/2)和Fe (2p 1/2)的结合能。在709.83、713.29、726.88 eV处对应为Fe(Ⅱ)的卫星峰，在 711.19、717.95、723.84 eV 处均表现为Fe(III)特征（Yamashita et al.，2008），是因为黑炭/零价铁复合材料中的零价铁被氧化生成三价铁化合物。图9d为Cr(Ⅵ)还原后耦合体系的Cr (2p) XPS谱图，Cr (2p)谱图显示有两对峰，说明铬离子以两种形式存在，586.40、577.89 eV处分别对应于Cr (2p 1/2)和Cr (2p 3/2)轨道，Cr (2p 3/2)可以进一步分峰（Pan et al.，2014；Park et al.，2008），其中在 Cr(Ⅵ)位于 577.89 eV，占比 25.75%，Cr(Ⅲ)分别位于576.44、586.40 eV，占33.57%和40.68%。这说明，Cr(Ⅵ)和 Cr(Ⅲ)可能会共同存在于耦合体系之中，但大部分的 Cr(Ⅵ)会被零价铁和铬还原菌还原为Cr(Ⅲ)。

3 结论

（1）从污染土壤中筛选出1株具有铬还原能力的菌株（编号GY-1）。通过16S rDNA鉴定，该铬还原菌为蜡样芽孢杆菌。

（2）黑炭/零价铁复合材料可作为固定化载体，为微生物生长提供更好的场所，被固定化的铬还原菌稳定性、抗毒性增强。耦合体系的初始 pH为 7和8时，适合菌株的生长，并具有较高的Cr(Ⅵ)去除效果。细菌在生长过程中的分泌物质能够自主调节溶液中pH值。

（3）通过测定耦合体系Fe(Ⅱ)及总Fe的浓度变化，说明微生物能还原零价铁钝化层的 Fe(Ⅲ)为Fe(Ⅱ)，生成的 Fe(Ⅱ)继续参与反应还原 Cr(Ⅵ)，产生循环效果

（4）通过XPS分析对去除Cr(Ⅵ)前后的材料进行表征分析，证明了反应后零价铁被氧化生成Fe(Ⅲ)化合物，大部分的 Cr(Ⅵ)会被零价铁和铬还原菌还原为Cr(Ⅲ)。