人体乳腺矿化集合体类型与临床相关性分析

张 岩，李 艳，程 潇，鲁安怀，王长秋，梅 放，柳剑英，王大翠

(1. 矿物环境功能北京市重点实验室， 北京大学， 北京 100871； 2. 北京大学医学部 基础医学院病理学系，北京 100083； 3. 钟祥市人民医院病理科， 湖北 钟祥 431900)

人体矿化可分为生理性矿化(功能性矿化)和病理性矿化。功能性矿化包括具有支撑人体结构功能的骨和具有咀嚼功能的牙齿等(Carlinfanteetal., 2003；Boskeyetal., 2007；Boonrungsimanetal., 2012)。病理性矿化与多种人体疾病相关，医学上通常描述为钙化、钙沉着或结石(韩志江，2012)，可出现在人体各个部位的病变中，包括脑膜瘤(杨若晨等， 2008)、甲状腺癌(赵文雯等， 2009)、乳腺癌(孟繁露等， 2013)、卵巢癌(熊翠娥等， 2011)、心血管疾病(朱梅倩等， 2011)等，其中一些特殊结构矿化已成为医学影像学手段进行肿瘤诊断的重要辅助手段(Hakaetal., 2002； Stone and Matousek, 2008)。

乳腺中的矿化作为乳腺癌早期诊断的重要指标，在X射线检查、超声检测、CT和核磁共振中得到了充分的运用(Lingetal., 2013)。其中乳腺X射线检查通过对乳腺微矿化的形态和分布进行系统的分类和界定，现已成为最重要的乳腺癌筛查项目(Gümüetal., 2013)。活检样品X光片中有矿化的病例诊断正确率高达99%，明显高于无矿化组的87%(Katsamenisetal., 2012)。调查发现，该种手段在50岁以下年龄段中存在较高的漏诊率(67%)，部分学者推测原因为50岁以下患者的肿瘤生长较快，未产生矿化(Tseetal., 2008)。在乳腺X射线的微矿化形态观察及分布区域界定时，受制于常规X光检查的分辨率(Bakeretal., 2007)，对于直径小于500 μm的可疑矿化与乳腺病变的关系当前仍缺乏探讨。随着学界对于乳腺影像检查漏诊率进一步降低的需求，以及现代影像学检测仪器分辨率的不断提高与功能的不断完善，500 μm以下可疑矿化物特征与乳腺病变的相关性则成为提高乳腺疾病早期检出率与诊断准确度的关键问题。

现代矿物学研究手段可在微纳尺度上对矿化物的形貌分布、化学组分和晶体结构进行精细研究。当前，针对人体矿化这一交叉领域的研究，前人已从医学或矿物学单一维度进行了深入系统的研究(Reinholzetal., 2001； Cölfen, 2010； 崔福斋， 2012； Coxetal., 2012)，在此基础上，将重要的医学指标年龄、疾病类型和肿瘤良恶性与矿物学500 μm以下显微形貌分类统计数据相结合，可对乳腺疾病临床影响诊断数据进行更加科学完善的分类，以便为探究钙化在乳腺疾病中的成因以及为乳腺癌临床精细诊断提供依据。

本文通过矿物形态学研究手段，对乳腺增生症、乳腺炎症、乳腺纤维腺瘤以及乳腺癌等123例乳腺良、恶性疾病开展了组织矿化的分类研究，统计计算了不同矿化集合体形态在不同患者年龄、不同疾病类型以及不同癌变阶段的比率，探讨了不同类型矿化集合体形貌差异及其对乳腺疾病良恶性的指示意义，为未来乳腺疾病医学影像学精确诊断提供参考。

1 材料与方法

从北京大学第三医院和湖北钟祥人民医院病历库中所存的2010年1月至今的所有与钙化相关的乳腺标本(以下各章样品来源同此)筛选出乳腺矿化病例共123例，患者年龄分布从21岁到86岁不等，平均年龄为50.0±12.3岁。其中乳腺癌77例(包括Tis期7例、T1期16例、T2期28例、T3期22例、其它4例无临床分期信息)，乳腺纤维腺瘤31例，乳腺增生症8例，乳腺炎症7例。在TNM肿瘤分期标准中，Tis期代表原位癌，而乳腺浸润性癌可根据肿瘤大小划分为T1期(癌瘤长径≤2 cm)、T2期(癌瘤长径2～5 cm)和T3期(癌瘤长径>5 cm)。用Leica超薄切片机对上述石蜡包埋样品块进行连续切片。对于每一例样品，取1张4 μm薄片制成普通苏木素-伊红(HE)玻片，1张10 μm薄片置于20 mm×20 mm硅片上制成硅质薄片，用于原位观察。利用北京大学物理学院场发射环境扫描电镜Quanta 200和北京大学地球与空间科学学院场发射环境扫描电镜Quanta 600进行二次电子像和背散射电子像观察，分辨率为3.5 nm。选取钙化较多的病例，将数张连续切片置于1.5 mL离心管中，进行分离处理。制样方法和步骤参见赵文雯等(2009)。病理科制备的苏木素-伊红染色切片(HE)中，乳腺组织矿化物呈深染。

利用JEM-2100F高分辨透射电镜拍摄电子衍射图像，选区大小约为200 nm×200 nm，使用measureIT软件对衍射环半径进行测量，计算出晶面间距，根据碳羟磷灰石(PDF#19-0272)或羟基磷灰石(PDF#09-0432)的标准晶面间距进行标定。在北京大学化学与分子工程学院利用NICOLET iN10 MX显微红外光谱仪对粉末样品进行透射模式的显微红外测试，分辨率4 cm-1。

通过光学显微镜(Nikon LV100 POL)对大量乳腺疾病病例的组织切片进行观察，按以下标准对乳腺组织矿化进行分类分级。其中，矿化程度分为+/-(仅见极个别小的粒状矿化，不超过10倍镜视域的2%)，+(可见少量散在粒状或不规则块状矿化，可占10倍镜视域的2%～10%)，++(可见较多量粒状或不规则块状矿化，可占10倍镜视域的10%～30%)及+++(粒体或不规则块状矿化极其丰富，可占10倍镜视域的30%以上)4级。

为考察矿化集合体类型与患者年龄、乳腺疾病类型以及癌变阶段的相关性，利用IBM SPSS Statistics 20软件对样品数据进行了统计学分析。分析方法为描述性统计中的交叉表，由于存在理论频数小于5的格子，进行Fisher精确检验，双侧精确sig，结果计为p。同步辐射X射线三维成像在北京同步辐射装置4W1A-X射线成像实验站进行。使用AB胶将样品固定在针尖上，置于样品台上进行测试。采用大视场模式获取吸收衬度像，测试能量为8 keV，分辨率100 nm。数据采用XMController软件进行处理，三维重构后导出逐帧图像、3D动画和断层图像。

2 结果与分析

2.1 乳腺疾病矿化样品的病理组织切片分级

通过光学显微镜(Nikon LV100 POL)下123例乳腺疾病矿化样品的病理组织切片观察，对乳腺组织矿化进行了分类分级。其中，矿化集合体类型分为粒状、块状和两种混合3组(图1)：粒状集合体为小于200 μm的规则粒状钙化，少部分有环带结构；块状集合体为大于200 μm的片状钙化，或略小于200 μm但形状非常不规则的钙化；粒状块状混合集合体，可观察到两种集合体，不限于同一视域。

2.2 乳腺疾病矿化集合体的物相组成

采用透射电子显微镜(TEM)和傅里叶变换显微红外光谱(FTIR)对分离出的矿化集合体粉末进行测试，以确定人体乳腺组织矿化的矿物物相。结果(图2)显示乳腺癌矿化、乳腺炎症矿化和乳腺增生症矿化的主要物相为碳羟磷灰石，而乳腺纤维腺瘤矿化的主要物相为羟基磷灰石。这两种矿物物相的主要差别在于(112)等晶面的发育程度。此外，也可观察到晶体在(002)方向上不同程度的择优取向，即在各电子衍射图中呈现为弧形而非完整的衍射环，在乳腺癌矿化中最明显，在乳腺纤维腺瘤矿化中最不明显。

2.3 矿化集合体扫描电镜下分类特征

粒状与块状集合体在扫描电子显微镜下的微形貌特征如图4所示。其中，块状集合体较为致密(图4a～4c)，内部无明显的特殊结构特征，以不规则矿化为主，集合体附近的胶原上可见明显的矿化小球(图4b)。粒状集合体个体之间的排列则较为松散(图4d～4f)，之间可见胶原纤维(图d)相连。无论是块状集合体还是粒状集合体，均无法观察到明显的单晶矿物，表明其均为纳米矿物集合体。

从集合体个体结构特征来看，粒状集合体具有明显的环带结构，环带间隙由有机质填充(图4d，4e)。结合同步辐射X射线三维成像，可以进一步确认在三维空间内具有环带结构的粒状集合体围绕一到两个核心从内到外生长(图5)。平面吸收衬度像(图5a)显示矿化颗粒中清晰的分层结构，与光镜和扫描电镜下观察结果一致。将旋转测试获得的721张平面图进行三维重构，获得矿化颗粒的三维高分辨像(图5b)，显示颗粒内部壳层在三维空间中的连续性。进一步可获得平行入射光方向的断层图(图5c)，显示该颗粒内部有2个核心。由于该粒状集合体有2个核心，且外部壳层连续，可知其由内向外生长。此外，三维高分辨像(图5b)清晰地显示出有环带结构的粒状集合体各层之间由有机物进行连接。

图 1 不同乳腺疾病中的不同类型、不同丰富程度的矿化Fig. 1 Different types and amounts of mineralization in different breast diseases

图 2 不同乳腺疾病矿化的选区电子衍射图Fig. 2 Electron diffraction patterns of mineralization in different breast diseases

图 3 不同乳腺疾病矿化的傅里叶变换显微红外光谱Fig. 3 Micro-FT-IR spectra of mineralization in different breast diseases

2.4 矿化集合体类型与患者年龄相关性

将患者年龄按照≤30岁、31～50岁、51～70岁和>70岁分为4个年龄组。统计分析结果(表1)显示，30岁以下年龄组中块状和粒状集合体占比分别为33.3%和50%；31～50岁年龄组中块状和粒状集合体占比分别为26.9%和53.7%；51～70岁年龄组中块状和粒状集合体占比分别为56.4% 和23.1%；70岁以上年龄组中块状和粒状集合体占比分别为63.6%和27.3%。各年龄组患者的乳腺组织矿化集合体类型差异具有显著性(p=0.018， <0.05)，随着年龄增加，块状集合体的出现概率增加，粒状集合体的出现概率减少，敏感分区年龄为50岁；粒状集合体在50岁以上和50岁以下患者中单独出现的概率分别为24%和53%。在图6中可以更为直观地看出这一差异：50岁以下患者的乳腺组织矿化以粒状集合体为主(72.6%)，而50岁以上患者的乳腺组织矿化以块状集合体为主(76%)。

图 4 电镜下的块状集合体(a～c)和粒状集合体(d～f)特征Fig. 4 ESEM images showing the morphology of granular aggregate (a～c) and mass aggregate (d～f)

图 5 人体乳腺微矿化的同步辐射光源X射线三维成像结果Fig. 5 Three-dimensional imaging results of breast cancer calcificationa—垂直入射光方向的平面图； b—三维重构图； c—平行入射光方向的断层图a—the plane perpendicular to the incident ray； b—three-dimensional restructuring graph； c—section plane parallel to the incident ray

2.5 矿化集合体类型与乳腺疾病类型相关性

针对不同乳腺疾病类型病例中的乳腺组织矿化集合体类型进行统计学分析，结果(表2)显示乳腺癌中块状与粒状集合体分别占比46.8%与33.8%；乳腺纤维腺瘤中块状与粒状集合体分别占比25.8%与64.5%；乳腺增生症中块状与粒状集合体分别占比37.5%与25.0%；乳腺炎症中块状与粒状集合体分别占比28.6%与42.9%。各矿化集合体类型在乳腺增生症、乳腺炎症、乳腺纤维腺瘤以及乳腺癌患者中的分布无显著差异性(p=0.057， >0.05)。仅考察108例乳腺肿瘤，即乳腺癌(恶性)和乳腺纤维腺瘤(良性)两个疾病类型组，则矿化集合体类型差异显著(p=0.016， <0.05)。在图7中可以更为直观地看出这一差异：乳腺癌患者中粒状集合体单独出现的概率(33.8%)远远低于乳腺纤维腺瘤患者中粒状集合体单独出现的概率(64.5%)；乳腺癌中出现矿化灶的概率较良性病变中多；在乳腺癌中不同矿化集合体类型分布无明显差异。

表 1 不同年龄组中乳腺组织矿化集合体类型的比较Table 1 Comparison of types of breast mineralization among different age groups

乳腺疾病类型块状粒状两种病例数构成比/%病例数构成比/%病例数构成比/%合计p值乳腺癌3646.8 2633.81519.577乳腺纤维腺瘤825.82064.539.731乳腺增生症337.5225.0337.58乳腺炎症228.6342.9228.67合计4939.85141.5 2318.7123p=0.057,只考察乳腺癌和乳腺纤维腺瘤p=0.016

图 7 不同乳腺疾病中矿化集合体类型的比较Fig. 7 Comparison of types of breast mineralization in different breast diseases

2.6 矿化集合体类型与癌变阶段相关性

针对不同癌变阶段病例中的乳腺组织矿化集合体类型进行统计学分析，结果(表3)显示乳腺原位癌(Tis期)中块状集合体占比71.4%，粒状集合体占比为0；乳腺浸润性癌T1期中块状与粒状集合体占比分别为18.8%与43.8%；乳腺浸润性癌T2期中块状与粒状集合体占比分别为60.7%与21.4%；乳腺浸润性癌T3期中块状与粒状集合体占比分别为36.4%与54.5%。乳腺原位癌(Tis期)和乳腺浸润性癌T1、T2、T3期患者的乳腺组织矿化程度差异具有显著性(p=0.008， <0.05)。在图8中可以更为直观地看出这一差异：所有乳腺原位癌矿化均出现了块状集合体(100%)， T2期病例中乳腺组织矿化块状集合体的出现概率也较高，为78.6%。相对而言，T1和T3期病例中矿化中块状集合体出现的概率明显降低，分别占56.2%和45.5%。粒状集合体在T3期病例中单独出现的概率最高，为54.5%。此外值得关注的是，乳腺原位癌病例中不存在仅含有粒状矿化集合体的情况。

表 3 不同癌变阶段乳腺组织矿化集合体类型的比较Table 3 Comparison of types of breast mineralization among different cancer stages

图 8 不同癌变阶段乳腺组织矿化程度的比较Fig. 8 Comparison of types of breast mineralization among different cancer stages

3 讨论

3.1 块状与粒状集合体形貌差异

影像学上主要通过钙化的形态和分布对乳腺钙化进行分类。例如：可疑钙化细线样或细线样分支状钙化描述为细而不规则线样钙化，直径小于500 μm，常不连续，有时也可见分支状，提示钙化是由于被乳腺癌侵犯在导管腔内形成，其恶性的阳性预测值约为70%，乳腺影像数据报告系统中分类应为高度可疑恶性但不肯定，建议进行活检(中国抗癌协会乳腺癌专业委员会， 2015)。病理学上，将具有环带的尺寸较小的钙化颗粒称为砂粒体，导管坏死中成片的钙化称为坏死性钙化。然而这两种钙化的分类并不能囊括所有乳腺组织钙化的形态，对于一些微小钙化，由于其环带结构十分模糊，并不符合沙砾体钙化的定义，而大部分尺寸较大的钙化并不与坏死组织直接接触也无法确定其坏死成因，因而不适于统称为坏死型钙化。医学影像学上对于钙化的最小尺寸界定标准直径500 μm，医学影像学上未关注到的微小钙化在光镜和电镜下需要进一步细分。

结合光镜和扫描电镜的观察可以发现，块状集合体较为致密，内部无明显的特殊结构特征，与胶原纤维联系紧密。块状集合体附近，钙化小球分布较密集；而远离块状集合体的部位，钙化小球分布较稀疏。块状集合体边缘由钙化小球堆积而成。成堆的钙化小球间被絮状物充填，整体形态已接近块状钙化，但比较松散。钙化小球直径约在 0.1～5 μm之间，依附胶原纤维生长。最初观察到钙化小球分散并被胶原纤维包围。在粒状集合体中，小球形颗粒最终形成致密聚集体，而在块状集合体中观察到的小球形颗粒则相对松散地沉积在矿化和周围组织之间的边界处，相对而言，良性组织中块状集合体和粒状集合体的表面比恶性中的表面更平滑。

块状与粒状集合体宏观的形貌差异一定对应着微观的矿物组分及结构差异，但在本文中通过对人体乳腺组织微矿化的物相组成进行分析，发现乳腺癌、乳腺炎症和乳腺增生症矿化的主要物相均为碳羟磷灰石Ca5[PO4,CO3]3(OH) (CHA， PDF#19-0272)，而乳腺纤维腺瘤矿化的主要物相为羟基磷灰石Ca5(PO4)3(OH)(HA， PDF#09-0432)，但这两种物相极为相似，其结构上的差异主要由于碳酸根的替代量不同而产生，不同矿物集合体之间并未出现组构上的明显不同。

3.2 矿化集合体类型对乳腺病变良恶性的指示意义

在病理学观察实践中，人体乳腺组织矿化的形态和尺寸的确呈现出一定的差异性，对其中规律的揭示，有利于对病理学诊断提供参考。在文中的分类体系下，可以看出矿化集合体类型与患者年龄、乳腺疾病类型、癌变阶段存在一定相关性，总结于表4中。

表 4 矿化集合体类型与患者年龄、病变类型的统计对应关系Table 4 The statistical corresponding relationship between the type of mineralization aggregation and the patient’s age as well as the pathological type

结合钙化的形貌特征可以判断，大部分块状集合体均一致密，应是钙化的最终产物，且会随着沉积时间的持续钙化物尺寸不断增大，因此该类矿化集合体在50岁以上患者中出现概率较高，但部分坏死型钙化也会出现短时间的大量钙化堆积，因而块状结合体在低年龄患者群体中也会出现。乳腺纤维腺瘤中胶原纤维十分丰富，大量矿化小球在胶原上生长，而小球附近的胶原又发生矿化作用，后矿化生成的小球在较早生成的小球上生长，随着时间的推移，堆积形成了较大的砂粒体颗粒，因而产生块状集合体的概率较低。数据结果与上述分析也较为吻合，块状集合体更多地出现在50岁以上患者中(58%)，在乳腺原位癌(71.4%)和乳腺浸润性癌T2期(60.7%)患者中占主导，而粒状集合体更多地出现在50岁以下患者中(53.4%)，在乳腺纤维腺瘤(64.5%)和乳腺浸润性癌T1期(43.8%)、T3期(54.5%)患者中占主导。这一辅助诊断标准在病理学诊断中极易推广使用。在诊断实践中，如果块状集合体出现在50岁以下的患者中，则其患乳腺癌的概率更高，且为乳腺原位癌(Tis)或乳腺浸润性癌T2期可能性大。此外，由于乳腺原位癌病例中不存在仅含有粒状矿化集合体的情况(表3)，因此仅观察到粒状矿化集合体时，所患癌症为浸润性癌可能性大。这一结果对乳腺癌病理学诊断提供了全新的可行性方法，可起到重要的辅助诊断作用。

乳房X射线照相术是早期发现乳腺癌的最有效筛查方法。美国食品药品监督管理局鼓励女性做到根据筛查指南或医师建议，定期接受乳房X射线照相检查，相对来讲，肿瘤早期是最容易治疗的阶段。但乳房X射线照相术在普查过程中，40～49岁妇女的生存没有得到改观，而50～60岁的妇女确能明显受益于乳房X射线照相术普查。医学上普遍认为这是由于年轻女性的肿瘤生长较快导致的(张安秦等， 2000)，本文的研究可以较为合理的解释这一现象，乳腺X射线的分辨率只能识别100 μm以上的钙化，主要集中在块状集合体这一区域，从表4中可以看到块状集合体主要出现在50岁以上患者中，占比高达(58%)，因此在这一年龄区间乳房X线普查具有极高的敏感性，漏诊率较低。而在发生乳腺纤维腺瘤以及乳腺癌的年轻患者中(小于50岁)，虽然病变过程中也出现了钙化，但钙化以粒状集合体为主(53.4%)，影像学手段无法识别，因此乳房X射线检查的敏感性较差，漏诊率较高。

4 结论

选取乳腺癌、乳腺纤维腺瘤、乳腺增生症、乳腺炎症共123例乳腺钙化样品，重点探讨了乳腺矿化集合体类型与患者年龄，患者乳腺病变类型和癌变阶段的关系。其中块状集合体更多地出现在50岁以上患者中(58%)，在乳腺原位癌(71.4%)和乳腺浸润性癌T2期(60.7%)患者中占主导；粒状集合体更多地出现在50岁以下患者中(53.4%)，在乳腺纤维腺瘤(64.5%)和乳腺浸润性癌T1期(43.8%)、T3期(54.5%)患者中占主导；乳腺原位癌中不存在仅含有粒状集合体的情况，观察到粒状矿化集合体时，所患癌症为浸润性癌可能性大。本研究可为未来乳腺癌的诊断提供基于乳腺矿化精细矿物学特征的辅助新方法。