八味伤科活血片提取工艺优化及三七皂苷R1的HPLC含量测定

黄伟群，曾聪彦，胡玉良，辛晓芳，董杰英

（广州中医药大学附属中山中医院，广东中山528400）

八味伤科活血片为广东省中山市中医院的医院制剂，处方以桃红四物汤加减，方中三七、桃仁、红花破血逐瘀，同为君药；泽兰、赤芍、当归增强君药活血化瘀之力，共为臣药；生地黄滋阴清热，既清血瘀之热毒，又祛瘀而不伤血，为佐药；甘草调和诸药，为使药。诸药相伍，共奏活血祛瘀、通络止痛之功效。目前该制剂在临床上用于跌打损伤初期已取得良好效果［1］。本文选取干浸膏收得率与总黄酮含量为考察指标，利用正交设计优化提取工艺，优化八味伤科活血片的工艺条件；并建立三七皂苷R1的HPLC含量测定方法，为八味伤科活血片质量控制提供方法学参考。

1 仪器与材料

1.1 仪 器

高效液相色谱仪（Agilent 1100系列）；Good See-I型薄层色谱摄影仪（上海科哲生化科技有限公司）；加强型玻璃点样毛细管（华西医科大学仪器厂生产）；IXUS115HS-Canon数码相机（佳能（中国）有限公司）；KQ5200E型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；JA1203型电子天平（上海天平仪器厂）；BS224S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；东方-A型直热式电热恒温干燥箱（广州东方电热干燥设备厂）；UV2550紫外分光光度计（郑州今迈衡器有限公司）；RE-2000B旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；CRLB-1500S电炉（肇庆金雅乐电器有限公司）；JP-300A高速多功能粉碎机（永康市久品工贸有限公司）；800型离心机（上海手术机械厂）；TC-15套式恒温器（浙江新华医疗器械厂）。

1.2 试药与试剂

八味伤科活血片（中山市中医院制剂室提供，3批次批号分别是:20160831，20161104，20170210）；所用药材均为饮片，购自广州康圣药业有限公司。三七皂苷R1对照品（批号110745-200617），购自中国食品药品检定研究院。HPLC用甲醇、乙腈均为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 提取工艺优化方法与结果

2.1 提取工艺

按1日处方量，分别称取桃仁、地黄、红花、泽兰、赤芍、甘草，加热回流提取，提取液纱布过滤，收集滤液，浓缩，定容至100 mL，得提取液。

2.2 干浸膏收得率测定方法

精密移取各提取液10 mL，平行3份，置已干燥至恒重的已知重量的蒸发皿中，水浴蒸干后，置于105℃的烘箱中，干燥3 h后，迅速移至干燥器中，待冷却30 min后，精密称定重量，记录数据，计算平均值。

膏量（g），V为药液总体积（mL），W1为药材（除去三七、当归）的重量（g），V1为测定用药液体积（mL）。

2.3 总黄酮含量测定方法的建立

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品0.006 1g，置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，得芦丁对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密移取提取液1 mL，置5 mL容量瓶中，加入60%乙醇溶液稀释至刻度线，摇匀，超声30 min，离心5 min；精密吸取上层澄清溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀后静置6 min；加入10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀后静置6 min；再加入4.3%氢氧化钠溶液10 mL，摇匀，加入60%乙醇溶液稀释至刻度线，摇匀。

2.3.3 最大吸收波长的测定 精密量取芦丁对照品溶液10 mL，平行3份，置于25 mL容量瓶中，同“2.3.2 供试品溶液的制备”项下操作，制得 48.8 μg/mL对照品溶液。放置15 min，取适量溶液置于比色皿中，在波长400 nm～600 nm范围内测定最大吸收波长，计算平均值，结果芦丁对照品溶液在509 nm处有最大吸收。

2.3.4 标准曲线的制备 分别精密移取芦丁对照品溶液 2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置于 25 mL容量瓶中，同“2.3.2 供试品溶液的制备”项下操作，制得 9.76 μg/mL、19.52 μg/mL、29.28 μg/mL、39.04 μg/mL、48.8 μg/mL 对照品溶液。并以 60%乙醇溶液作为空白对照溶液，按照紫外-可见分光光度法进行操作，于509 nm波长处测定溶液的吸光度值。以溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制芦丁标准曲线。得回归方程为Y=11.773X+0.000 5，R2=0.999 8。

2.4 提取工艺优化

2.4.1 正交优化 以干浸膏收得率和总黄酮含量为指标，选择浸泡时间、料液比例、提取时间、提取次数为考察因素，选用L9（34）正交试验表进行提取正交试验。把黄酮含量的权衡系数定为0.6，干浸膏得率的权衡系数定为0.4。正交试验方案与结果见表 1。综合值（g）=总黄酮含量（g）×0.6+干浸膏得率×药材体质量（g）×0.4

表1 L9（34）正交试验方案与结果

由表1可知，影响提取工艺的因素大小顺序为 D＞B＞C＞A，即提取次数＞加水量＞提取时间＞浸泡时间；最佳提取方案为A3B3C2D3，即加10倍量的水浸泡1 h，加热提取3次，每次1.5 h。表2数据表明，提取次数 D3＞D2＞D1，D2与 D3差异较少，考虑生产成本，选择D2提取2次；不同浸泡时间（因素A）对工艺影响最小，减少浸泡时间可提高生产效率。因此，最佳工艺为A1B3C2D2，即加入10倍量的水加热提取2次，每次1.5 h。

2.4.2 工艺验证 为了保证上述优选工艺条件的重现性和可行性，取除三七、当归外的其余药味饮片各3份，每份称取1日处方量，置圆底烧瓶中，按照A1B3C2D2制备样品溶液。分别精密量取提取液10 mL与1 mL，同“2.2干浸膏得率测定方法与结果”与“2.3总黄酮含量测定方法的建立”项下操作，制得供试品溶液，并测定干浸膏得率和总黄酮含量，求出RSD值，结果见表3。

表3数据表明，干浸膏得率的RSD为1.6%＜2.0%，总黄酮含量的RSD值为 3.9%＜4.0%，说明工艺稳定可行，有效成分提出率高。

表2 L（934）正交试验方差分析表

表3 验证结果

3 三七皂苷R1含量的HPLC测定方法与结果

3.1 色谱条件

色谱柱 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温25℃；以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0 min:5%A～95%B；15 min:10%A～90%B；28 min:15%A～85%B）；流速 1.0 mL/min；检测波长203 nm；进样量20 μL。理论塔板数大于2000，分离度大于 1.5。

3.2 溶液的制备

3.2.1 对照品溶液 精密称取三七皂苷R1对照品，置于5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得浓度为3.88 mg/mL三七皂苷R1对照品溶液。

3.2.2 供试品溶液 取八味伤科活血片适量，去包衣，研磨成粉，置于干燥洁净的锥形瓶中，精密称取50 mL的甲醇溶液，加入锥形瓶中，称定并记录重量，放置过夜，于80℃的水浴中加热微沸2 h，放凉至室温后称重，并加甲醇溶液至原先称定的重量后，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

3.2.3 阴性溶液 按照八味伤科活血片的制备工艺，制成缺三七的阴性样品，按照“3.2.2”项下操作，制成缺三七的阴性对照品溶液。

3.3 方法学考察

3.3.1 专属性 按3.1项下色谱条件，测定对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，分别进样20 μL，记录色谱图。如图1所示，在三七皂苷R1色谱峰位置上，阴性无干扰，表明本实验的测定方法专属性好。

图1 八味伤科活血片HPLC图

3.3.2 标准曲线的制备 精密移取“3.2.1”项下的对照品溶液适量，制成 0.388 mg/mL、0.776 mg/mL、0.970 mg/mL、1.940 mg/mL、3.880 mg/mL 的不同浓度对照品溶液。按照3.1项下色谱条件，分别进样20 μL。以对照品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，回归方程为Y=3172X+3513，R2=0.999 8，表明三七皂苷 R1在 0.388 mg/mL～3.880 mg/mL范围内线性关系良好。

3.3.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液（3.880 mg/mL）20 μL，连续进样 6 次，测定峰面积。峰面积RSD=0.03%，表明仪器精密度良好。

3.3.4 重复性试验 取同一批次（批号:20161104）样品，精密称取 8 份，按“3.2.2”项下方法制备供试液，依法测定供试品溶液中三七皂苷R1的峰面积。结果峰面积RSD=0.05%。说明方法重现性良好。

3.3.5 稳定性试验 精密量取同一份供试品溶液6份，分别于 0 h，2 h，4 h，6 h，10 h，22 h，26 h和 32 h进样，结果三七皂苷R1峰面积RSD为0.03%，表明供试品溶液在32 h内稳定性良好。

3.3.6 加样回收率试验 取已知含量的八味伤科活血片（批号 20161104）约 2.0 g，共 6 份，精密称定。分别精密加入三七皂苷R1对照品0.011 7 mg，按“3.2.2”项下方法制备供试液，按“3.1”项下色谱条件测定含量，计算加样回收率。加样回收率为93.16%，RSD=1.2%，表明三七皂苷 R1的加样回收试验良好，符合定量分析要求。结果见表4。

表4 加样回收率试验

3.3.7 样品含量测定 取八味伤科活血片3批（批号 20160831，20161104，20170210），按“3.2.2”项下方法制备供试液，依法测定，计算供试品中三七皂苷R1的含量，结果见表5。

表5 含量测定结果

4 讨 论

八味伤科活血片可改善临床髋部周围骨折患者的血液循环，消除其肢体肿胀。方中选用生三七为君药，具止血活血、强心定痛、消肿散瘀功效［2］，药理活性表现为抗炎、止血、抗衰老等［3］，主要活性成分为三七皂苷［3］，如三七皂苷 R1、人参皂苷Rg1、Rb1［4］。三七为贵细药物，故将其打粉入药，保证其充分利用，并建立HPLC对成品中三七皂苷R1进行质量监控，保证不同批次的八味伤科活血片中三七含量的稳定性。

八味伤科活血片原工艺重现性较差，仅以浸出物为质控指标。八味伤科活血片方中桃仁、红花、泽兰主要含黄酮类成分［5-6］，所以本实验紫外分光光度法测定总黄酮含量，并结合干浸膏收得率，共为工艺优化考察指标。通过正交试验筛选提取工艺，优化的工艺条件重现性好，质控性强，最佳工艺为10倍量的水加热提取2次，每次1.5 h。实验中未对正交试验4因素进行单因素考察，考虑到实际生产情况，为节约时间和经济成本，优选工艺中省去了浸泡时间。