大白菜软腐病拮抗菌的筛选、鉴定及其防效研究

王彪 崔文艳 武君洁

摘要 为筛选对大白菜软腐病具有较好拮抗效果的生防菌株，采用对峙平板法分别从作物根际土、发酵池以及本实验室菌种库得到6株拮抗性较强的菌株ASR-12、ASR-23、ASR-31、ASR-54、ASR-55、ASR-150。在离体叶柄软腐防效试验中，采用注射接种法获得了拮抗性较强的3株拮抗菌ASR-12、ASR-23和ASR-150，48 h的防效分别达到了87.64%、80.90%和70.79%。温室防效试验的结果表明：菌株ASR-12、ASR-23和ASR-150防治效果分别为59.22%、59.21%和55.00%，显著高于72%农用链霉素可湿性粉剂的防效（39.15%），具有很好应用前景。依据形态、生理生化和分子鉴定，菌株ASR-12被鉴定为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。

关键词 拮抗菌; 筛选; 防效; 鉴定; 解淀粉芽胞杆菌

中图分类号： S 436.341.13  文献标识码： A  DOI： 10.16688/j.zwbh.2018416

Abstract In order to screen the antagonistic strains with good effects on soft rot of Chinese cabbage， a total of 6 strong antagonistic strains， ASR-12， ASR-23， ASR-31， ASR-54， ASR-55 and ASR-150， were isolated from the rhizosphere soil of the crops in the greenhouse， fermentation pool and bacterial bank through confrontation plate culture. Three antagonistic strains， ASR-12， ASR-23 and ASR-150， were selected for soft rot resistance test by petiole injection method of Chinese cabbage in vitro， and their control effects were 87.64%， 80.90% and 70.79%， respectively， in 48 h. The three strains were tested against soft rot in the greenhouse by spraying method， and the results showed that the control effects of the strains ASR-12， ASR-23 and ASR-150 were 59.22%， 59.21% and 55.00%， respectively， significantly better than 72% agricultural streptomycin wettable powders whose effect was 39.15%， indicating they have good application prospect. Based on morphological， physiological and biochemical and molecular identification， the strain ASR-12 was identified as Bacillus amyloliquefaciens.

Key words antagonistic bacteria; screening; control effect; identification; Bacillus amyloliquefaciens

软腐病是一种世界范围内的土传细菌性病害，主要由果胶杆菌属Pectobacterium细菌引起。我国主要包括胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum、胡萝卜软腐果胶杆菌黑胫亚种P.carotovorum subsp. atroseptica和菊迪基氏菌Dickeya chrysanthemi等[1-2]。除了危害大白菜以外，這些菌还可以侵染魔芋、胡萝卜、辣椒、番茄、马铃薯及马蹄莲等重要经济作物[1，3-4]，它们在侵染寄主的过程中，能够产生大量果胶酶，分解寄主植物组织细胞壁，产生臭味，致使寄主组织出现溃烂、浸渍等症状，严重时可导致整株死亡。

目前，人们主要采取选育抗病品种与化学农药相结合的方式来防治软腐病[5]。其中，化学农药见效快、防效好，但是长期使用不仅会污染环境，还会使病原菌产生耐药性，使药效下降。生物防治相较于化学农药具有选择性强、环境兼容性好、不易产生耐药性、生产原料广泛等优点[6]。随着现代农业生产的发展，利用环保安全的微生物防治植物病害变得越来越重要。为筛选得到对大白菜软腐病有较好防治效果的拮抗菌，本试验以作物根际土、污水池和菌种库为材料进行筛选， 经室内离体叶柄防效试验和温室软腐病防效试验进一步验证，对防效最好的拮抗菌株进行形态、生理生化、16S rDNA和gyrB基因序列分析鉴定，以期为深入开展该菌的生防机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

指示菌为软腐病菌SR-5，保存于本实验室; 部分待筛菌株取自本实验室菌种库。作物根际土和污水分别采集自微生物菌种筛选与应用国家地方联合工程研究中心温室大棚和发酵池（昆明安宁市青龙镇）。大白菜‘83-1（‘鲁春白1号）购自云南众乐农业科技有限公司。72%农用链霉素可湿性粉剂购自山东百士威农药有限公司。培养基为LB固体和LB液体培养基。

1.2 方法

1.2.1 生防菌的初筛

参考熊汉琴的双培养法[7]并略作修改： 1）取不同作物根际土烘干，称取5 g加入到45 mL无菌水中，37℃，160 r/min摇床上振荡培养30 min，用移液枪吸取部分做10倍梯度稀释; 2）直接取发酵池污水适当稀释。从-20℃冰箱取出软腐病菌SR-5于LB固体平板上活化，次日挑取单菌落于LB液体培养基中过夜培养。调整浓度约为107 cfu/mL，分别与带菌土壤稀释液和污水稀释液按1∶1等体积混合，用移液枪吸取200 μL混合液均匀涂布在LB固体平板上，置于37℃恒温培养箱内培养，24 h后观察有无抑菌圈产生。挑取有抑菌作用的菌落并连续纯化3代以上保存。

同时采用点接法从菌种库内现有的1 000株菌株中筛选潜在软腐病生防菌。从-80℃内取出保存在甘油中的菌划线活化，将200 μL SR-5菌悬液（107 cfu/mL）均匀涂布到LB固体培养基上，用牙签挑取活化的待测菌株点接在平板上，置于37℃恒温培养箱内。24 h后观察有无抑菌圈出现，记录并保存有良好抑菌作用的菌株。

1.2.2 复筛

用点接法将初筛保存的所有菌株点接到涂布有200 μL SR-5菌株（107 cfu/mL）的LB固体平板上，每个菌株3次重复，培养24 h后采用十字交叉法测量抑菌圈直径与菌落直径，计算相对抑制比值。

相对抑制比值=抑菌圈直径/菌落直径。

1.2.3 离体叶柄软腐防效试验

菌悬液制备： 分别挑取拮抗性较强菌株和指示菌SR-5接种于LB液体培养基内，置于37℃恒温摇床上培养48 h，采用稀释涂布法调整菌液浓度，拮抗菌约108 cfu/mL，指示菌约106 cfu/mL。

取健康的白菜叶片，将叶柄剪成大小约3 cm×5 cm的片段，表面用75%乙醇消毒。处理方法参考Zhao等[8]并适当修改，取规格90 mm灭菌培养皿，内铺两层灭菌滤纸片，并加适量无菌水保湿，每皿放置1个叶柄片段。设置处理如下： 以接种LB液体培养基的处理为空白对照; 以只接种软腐病菌SR-5的处理为阴性对照; 接种100 μg/mL氯霉素的处理为化学对照; 接种待选拮抗菌（108 cfu/mL）为处理组。先接种拮抗菌，4 h后再接种软腐病菌。其中，指示菌SR-5（约106 cfu/mL）与待筛选生防菌（约108 cfu/mL）均采用注射接种法，即使用移液枪将菌液注射入叶柄片段内，每个片段均匀注射3个孔，每孔病原菌与生防菌的接种量均为10 μL。以3个叶柄片段为1个重复，每个处理设置5个重复。培养皿用保鲜膜封口，置于35℃恒温培养箱内保湿培养。48 h后调查各处理叶片腐烂情况。分级标准如下：0级： 伤口处无软腐病斑; 1级： 伤口处出现黄褐色水渍状病斑; 3级： 叶片腐烂面积在10%以下; 5级： 叶片腐烂面积在10%～30%; 7级： 叶片腐烂面积达31%～50%; 9级： 软腐面积在50%以上。

1.2.4 温室大棚软腐防效试验

试验于2018年3月-4月在安宁微生物筛选与应用国家与地方联合工程研究中心温室大棚进行。菌悬液制备方法同1.2.3。

试验设计拮抗菌处理、化学药剂处理（1 000倍72%农用链霉素可湿性粉剂），以只接种软腐病菌SR-5的处理做阴性对照（CK），每处理3个重复，每个重复30株大白菜。在白菜包心初期开始第1次处理，喷施方法及用量参考王超等[9]，在白菜茎基部喷施拮抗菌的菌液（108 cfu/mL），以叶表湿润且菌液不下流为宜。2 d后开始喷施软腐病菌（106 cfu/mL），之后每隔7 d喷施1次拮抗菌，共喷施3次，于最后1次处理后7 d调查病情，并计算防效，分级标准参考谢德龄等[10]。

1.2.5 鉴定

1.2.5.1 形态、生理生化鉴定

对菌株ASR-12进行鉴定，以确定其分类地位。测试性状及方法参考文献[1]。

1.2.5.2 分子鉴定

参考Cheng等[11]的方法提取细菌基因组DNA。以基因组DNA为模板，使用细菌16S rDNA和gyrB通用引物扩增相应基因片段。其中，反应体系参考熊国如等[12]，扩增程序如下： 94℃ 4 min 30 s;94℃ 30 s，54℃ 40 s，72℃ 1 min 30 s，30个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物送昆明硕擎科技生物有限公司测序。

1.3 统计分析

本试验中所有数据均利用SPSS 20軟件处理，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 筛选结果

分别从作物根际土和污水发酵池中获得5株和3株对软腐病菌有抑制作用的拮抗菌，从菌种库中筛得142株拮抗菌，分别对其进行编号ASR-1至ASR-142（来自菌种库）、ASR-143至ASR-147（来自作物根际土）、ASR-148至ASR-150（来自发酵池）。

复筛得到6株对软腐病菌有较强抑制作用的拮抗菌，编号分别为ASR-12、ASR-23、ASR-31、ASR-54和ASR-55、ASR-150。其中ASR-12、ASR-23和ASR-150的抑菌圈直径分别为11.5、10.33和6.83 mm，它们的抑菌圈直径与菌落直径的比值分别达到了2.57、2.22和2.16，其余3株拮抗菌的抑菌圈直径与菌落直径比值也都在1.6以上，具体数据见表2，图1为拮抗菌对软腐病菌抑制作用效果图。

2.2 离体叶片软腐防效

处理48 h后调查发病情况，从图2和表3来看，只接种病原菌的对照伤口附近出现明显的水渍状软腐病斑，腐烂情况较严重，病情指数高达65.93; 空白对照未出现腐烂情况; 化学对照伤口附近几乎没有出现软腐病斑，防效高达96.63%; 拮抗菌ASR-12、ASR-23和ASR-150处理的大白菜伤口附近部分出现腐烂情况，它们的防效分别达到了87.64%、80.90%和70.79%，其中拮抗菌处理ASR-12和ASR-23与化学对照之间差异不显著。

2.3 溫室大棚软腐防效

试验于2018年4月初开始调查，只接病原菌的对照处理发病已比较严重，病情指数高达74.07; 农用链霉素对照病情指数为45.07，防效仅为39.15%; 拮抗菌ASR-12、ASR-23和ASR-150处理发病较轻，防治效果均显著优于72%农用链霉素可湿性粉剂对照，分别达59.22%、59.21%和55.00%（表4）。

2.4 拮抗菌形态鉴定结果

对菌株ASR-12形态鉴定的结果表明，菌株ASR-12在LB固体培养基上于37℃恒温培养箱中培养，培养初期菌落乳白色、脓状、圆形、边缘整齐，培养后期菌落表面凹陷，表面干燥有褶皱。革兰氏染色呈阳性，菌体杆状，产芽胞。

2.5 生理生化鉴定结果

ASR-12的生理生化反应表现为：在2%、5%、7%和10%的盐浓度下能正常生长，在30、40和55℃下能正常生长，5℃下不能正常生长，过氧化氢、明胶液化、淀粉水解、甲基红、V.P、产吲哚乙酸、柠檬酸盐利用等试验均为阳性，兼性厌氧，不分解尿素。这些特性与解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens相似。

2.6 分子鉴定结果

将菌株ASR-12测序结果利用DNAMAN软件进行拼接，结果显示16S rDNA和gyrB基因序列全长分别为1 441 bp和1 201 bp。将拼接结果分别输入NCBI（https：∥www.ncbi.nlm. nih. gov/）进行BLAST比对，与解淀粉芽胞杆菌的同源性均达到了99%。根据比对结果选取同源性较高菌株序列，利用MEGA 7.0软件采用邻接法构建系统发育树，结果见图4和图5。聚类分析将菌株ASR-12鉴定为解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens。

3 讨论

近年来，软腐病已成为制约大白菜等作物高产丰收的主要病害之一。由于化学防治对环境危害很大[13]，不符合绿色农业需求，因此筛选、发掘环境友好型的微生物菌株并开发成相应的产品应用到农业上防治植物病害已成为当前的研究热点[14-19]。本研究从安宁温室大棚作物根际土壤、发酵池以及实验室菌种库内1 000株菌株中筛选得到6株对软腐病菌SR-5拮抗性较强的菌株，其中ASR-12， ASR-23及ASR-150的抑菌圈直径与菌落直径比值均超过2.1，对软腐病菌抑制效果优异。室内离体大白菜叶柄组织防效试验显示，ASR-12、ASR-23及ASR-150均能有效地抑制叶柄组织中浸渍面积的扩大，且菌株ASR-12的防治效果显著优于ASR-23与ASR-150，与100 μg/mL氯霉素处理防效相仿。田间试验显示，拮抗菌ASR-12处理后软腐病病情指数下降了43.86百分点，防治效果（59.22%）显著优于72%链霉素可湿性粉剂对照（39.15%）。田间试验中化学药剂与生防菌剂对大白菜软腐病的防控效果低于室内试验，可能与田间病原菌的浓度与分布、微生物区系及温湿度、土壤pH、含水量等环境条件因素有关。ASR-12菌株经形态观察、生理生化及分子手段被鉴定为解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens。芽胞杆菌是最主要的几种植株根际促生菌（PGPR）之一，具有抗逆性强、对人畜无危害及易于开发为稳定生物制剂等优点，近几十年来被广泛开发应用于生物防治领域，能够较好地防控土传病害的芽胞杆菌屡见报道[20-22]。

此外，大白菜软腐病发病迅速，一旦植株出现可见的软腐病斑，可在短时间内使大白菜品质产量下降甚至整株倒伏死亡。本研究采用先接种生防菌再接种病原菌的方法测定拮抗菌对大白菜软腐病的预防效果，结果显示，拮抗菌ASR-12在温室软腐防效试验中的防效为59.22%，明显优于王超等[9]的48.29%，故在农业生产上对于大白菜软腐病的防治应该采用“预防为主，治疗为辅”的手段，即在软腐病高发的季节提前喷施生物制剂，以达到预防的目的。对其他生防方式和土传病害的防控亦有借鉴意义。此外，Hoda等[23]的研究结果表明，将3株拮抗菌Pf2、Bs3和Ra39组合后使用，其防治效果明显优于三者单独使用。本试验筛选得到的3株拮抗菌ASR-12、ASR-23和ASR-150在离体和温室试验中均有较好的防治效果，将其组合后使用的防效是否优于单独使用还有待进一步研究。

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（責任编辑： 田 喆）