蒙药巴特日七对小鼠胶质瘤的治疗作用及可能机制

红宇 王儒帅 赵盛 王睿君

(1内蒙古医科大学附属医院影像诊断科，内蒙古 呼和浩特 010050；2内蒙古医科大学研究生学院)

恶性胶质瘤发病快，70%～80%的患者多在发病半年之内确诊〔1,2〕。随着医疗技术及新药研发加快，针对胶质瘤的治疗手段取得较大进步，疗效亦有明显提升，但现实仍然面临诸多挑战，胶质瘤患者的预后和存活依然没有得到显著改善〔3〕，加强胶质瘤发病机制研究和治疗方法探索显得极为紧要，开发新的药物用于治疗胶质瘤对于提高患者疗效和预后具有重要意义，蒙药巴特日七又名为巴布敦朱日，是蒙医临床上治疗黏热症及肠刺痛的最常用方剂。临床研究表明巴特日七治疗治疗细菌性痢疾、扁桃体炎和银屑病等疾病均有显著的疗效〔4,5〕，蒙药巴特日七可明显抑制胃癌MGC8023和结肠癌LOVO细胞作用〔6〕，本研究通过建立人胶质瘤移植瘤模型，探讨蒙药巴特日七对胶质瘤治疗作用，并就其机制作初步探讨。

1 材料与方法

1.1实验材料 U251 胶质瘤细胞购自中国科学院上海生物学研究所。SPF 级雄性C57BL/6 小鼠，来源北京维通利华动物实验中心。

1.2试剂 巴特日七味丸(内蒙古蒙药股份有限公司)。胎牛血清购自Gibco公司，DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国Invitrogen公司，PAMAM和FA购自美国Sigma公司。兔抗小鼠的高迁移率族蛋白(HMG)B1、Toll样受体(TLR)4、核因子(NF)-κB和β-actin多克隆抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶耦联山羊抗兔IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量试剂盒、电光学发光(ECL)显色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。RIPA裂解液、Trizol 试剂盒、逆转录试剂盒购自天根生化科技北京有限公司)，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ购自宝日生物技术北京有限公司，引物由上海生工生物合成，Applied Biosystem 7500快速荧光定量PCR仪。垂直电泳槽和电转仪购自北京六一仪器厂，水平摇床购自江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3实验方法

1.3.1小鼠胶质瘤模型构建 取对数生长期U251 细胞，胰蛋白酶消化，离心去上清，计算细胞数，磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，置于37℃水浴备用。麻醉小鼠，将小鼠固定于立体定向仪上，剪去头顶部眼裂至外耳道之间的毛发，常规消毒铺单，于中线处眼裂后作一长约1.0 cm垂直切口，暴露前囟，取其前方1.0 mm，右侧距中线1.0 mm处钻孔，其直径约为1.0 mm，用微量注射器吸取4 μl细胞悬液，调整移动架位置，使针尖位于骨孔处，缓慢垂直进针，持续注射10 min，缓慢拔针，以骨蜡封闭骨窗，逐层缝合关颅，固定于电极移动架上。正常饲养(57BL/6小鼠作为对照组)。

1.3.2治疗方法 将模型分为四组：对照组注射无菌生理盐水；低剂量治疗组注射巴特日七味丸20 mg/kg；中剂量治疗组注射巴特日七味丸40 mg/kg；高剂量治疗组注射巴特日七味丸80 mg/kg，每组20只。每天灌胃给药1次，每隔1 d测量肿瘤变化，治疗12 d，脱臼处死，取肿瘤组织，并取出肿瘤称重记录，计算肿瘤体积，计算抑瘤率，体积抑瘤率(%)=(实验组平均瘤体积/模型组平均瘤体积)×100%。肿瘤组织一部分用甲醛溶液保存，一部分放入液氮保存。本实验经伦理委员会批准。

1.3.3肿瘤组织细胞凋亡情况 TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况，将制备好石蜡切片按试剂盒说明书进行操作，于光镜下观察，若细胞核内为棕黄色即为阳性细胞。随机选择并计算5个高倍视野中凋亡指数(AI)。AI=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

1.3.4Western印迹检测HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白水平 解冻组织，加RIPA裂解液裂解，12 000 r/min，4℃，离心30 min，取上清。采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，上样50 g，根据浓度计算各个样品所需体积，按1∶5加上样缓冲液，随后进行电泳，电泳完成后，切胶。随后进行转膜，200 mA，120 min。5%的脱脂牛奶封闭，室温水平摇床2 h。用封闭液稀释相应的HMGB1、TLR4和NF-κB一抗，使PVDF膜浸泡于TBST中，4℃孵育过夜。PBST洗3次，每次5 min，辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗按1∶50 000稀释，孵育HRP标记的二抗，PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵育2 h。TBST清洗PVDF膜3次，5 min/次。加入ECL底物液，孵育3 min。放入显影液显影、定影液定影。采用IMAJ软件对目标图像进行灰度值分析，并进行统计学分析。

1.3.5RT-qPCR检测HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表达水平 解冻组织，用Trizol 试剂盒提取总RNA，均在冰上进行操作，检测总RNA总RNA浓度。按照反转录试剂盒操作步骤,将RNA反转录为cDNA,以cDNA 为模板进行RT-qPCR 定量检测。GAPDH 作为内参,引物序列：HMGB1正义链5'-GCGAGCATCCTGGCTTATC-3',HMGB1反义链5'-TTCAGCTTGGCAGCTTTCT-3';TLR4正义链5'-AGCAGGTGGAATTGTATCGC-3',TLR4反义链5'-TCAGGTCCAAGTTGCCGTTT-3';NF-κB正义链5'-GCATTCTGACCTTGCCTATCT-3',NF-κB反义链5'-CTCCAGTCTCCGAGTGAAGC-3';GAPDH正义链5'-ACCCCAGCAAGGACACTGAGCAAG-3',GAPDH反义链5'-GGCCCCTCCTGTTATTATGGGGGT-3'。反应体系为：主要混合物12.5 μl，正义链0.25 μl，反应链0.25 μl，模数2.5 μl，ddH2O加至20 μl，反应程序为预变性98℃,2 min;98℃变性30 s;60℃退火30 s，72℃延伸1 min，40个循环，72℃，5 min。监测荧光信号,获得相应Ct 值。每样本设3次重复，计算平均Ct值，根据2-ΔΔCt法表示获取mRNA相对表达水平。

1.4统计分析 采用SPSS22.0统计软件进行t检验、方差分析及χ2检验。

2 结 果

2.1蒙药巴特日七抑制肿瘤生长 治疗12 d后，分析各剂量组的肿瘤抑制情况。与模型组比较，蒙药巴特日七的抑制作用呈剂量依赖性关系(P<0.05)，见表1。

表1 肿瘤体积和抑制率

与模型组比较：1)P<0.05；与低剂量组比较：2)P<0.05；与中剂量组比较：3)P<0.05，下表同

2.2胶质瘤细胞凋亡指数 TUNEL法检测结果显示，模型组AI为〔(10.64±1.36)%〕，与对照组〔(41.25±5.16)%〕相比，明显降低(P<0.05)，蒙药巴特日七治疗后，AI明显增加，且随着剂量的增加，AI增加越明显〔低剂量组(18.13±2.29)%，中剂量组(25.36±3.15)%，高剂量组(33.52±4.28)%,P<0.05〕。

2.3HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达 Western印迹结果显示，与模型组相比，蒙药巴特日七治疗后HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白明显降低，且随着剂量增加，蛋白减弱越明显，呈现剂量效应关系(P<0.05)，见图1，表2。

图1 HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达

组别HMGB1TLR4NF-κB模型组0.98±0.050.89±0.051.47±0.11低剂量组0.76±0.031)0.67±0.041)1.19±0.091)中剂量组0.51±0.021)2)0.43±0.061)2)1.02±0.061)2)高剂量组0.22±0.031)2)3)0.19±0.021)2)3)0.45±0.031)2)3)

2.4HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表达 RT-qPCR结果结果显示，与模型组相比，HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表达水平明显增加(P<0.05)，蒙药巴特日七治疗后三种 mRNA明显减弱，且随着剂量增加， mRNA减弱越明显，呈现剂量效应关系(P<0.05)，见表3。

表3 各组HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表达

3 讨 论

胶质细胞瘤在手术中彻底切除肿瘤存在较大困难。故胶质瘤复发率高和预后较差。放化疗法能够杀死胶质瘤细胞，但其不具特异性，故会造成严重副反应，目前尚不明确发病机制，临床上尚未具备根本治疗的方法。因此，寻找新的有效的治疗药物仍然至关重要〔7,8〕。蒙药治疗肿瘤具有独特优势，用药少，其疗效好且安全性较高，且毒副作用低等优点，在抗肿瘤作用机制的研究逐渐成为医学热点。蒙药巴特日七味丸具有清热解毒、消黏的功效，为肠道及黏热症的常用主方，邓秀玲〔9〕研究显示蒙药巴特日七能抑制MGC-803细胞的增殖。研究发现，蒙药巴特日七味丸呈现剂量效应关系地抑制裸鼠移植瘤的生长〔10,11〕。肿瘤细胞之所以可无限增殖和生长，最重要的是细胞凋亡机制明显异常。HMGB1 属于一种染色质非组蛋白核蛋白〔12〕，细胞外的HMGB1可结合其受体TLR4激活细胞NF-κB通路，参与调节肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。有研究报道胶质瘤患者肿瘤组织中HMGB1、TLR4均与病理特征密切相关，HMGB1/TLR4/NF-κB可能直接参与胶质瘤的发病〔13,14〕。本研究提示蒙药巴特日七味丸可能通过调控HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路抑制胶质瘤。