2018 年北京协和医院细菌耐药性监测

刘文静，徐英春，杨启文，王 瑶，孙宏莉，赵 颖，刘亚丽，郭莉娜，窦红涛，朱任媛，张 丽，肖 盟，王 贺，张小江

北京协和医院自2005年开始参加CHINET细菌耐药监测网的工作，监测网每年公布的细菌耐药性监测数据给临床医师合理使用抗菌药物提供了参考依据，现将我院2018年临床分离菌的耐药性监测数据进行分析总结如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2018年1月1日－12月31日从北京协和医院临床分离的9 627株细菌，剔除同一患者相同部位重复分离株。凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）和草绿色链球菌只收集血液、脑脊液和无菌体液标本的菌株。

1.1.2 实验用材 药敏试验采用MH琼脂培养基，肺炎链球菌及其他链球菌用含5%脱纤维羊血MH琼脂培养基，流感嗜血杆菌用HTM培养基，上述培养基均为英国OXOID公司商品。抗菌药物纸片为英国OXOID公司商品。青霉素和万古霉素E试验条为郑州安图生物工程股份有限公司商品。替加环素最低抑菌浓度检测试纸条（MIC Test Strip，MTS）为意大利Liofilchem公司商品。药敏板卡N334、N335和P639中国定制卡为法国生物梅里埃公司商品。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定和药敏试验 细菌鉴定采用VITEK 2-Compact 和VITEK-MS质谱仪（法国生物梅里埃公司），药敏试验采用商品化的VITEK 配套中国定制卡、纸片扩散法和E试验法。具体为：草绿色链球菌、除无乳链球菌外其他β溶血链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌采用纸片扩散法，草绿色链球菌青霉素药敏试验和部分葡萄球菌属万古霉素药敏试验采用E试验法。肠杆菌科细菌、不发酵糖革兰阴性杆菌、葡萄球菌和无乳链球菌分别使用中国定制卡N334、N335和P639，卡上没有的抗菌药物，再用纸片扩散法补充药敏试验。

1.2.2 质控菌株 金黄色葡萄球菌ATCC 25923（纸片法）和ATCC 29213、粪肠球菌ATCC 25912、大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、肺炎链球菌ATCC 49619、流感嗜血杆菌ATCC 49247和ATCC 49766。

1.2.3 β内酰胺酶检测 采用头孢硝噻吩纸片（英国OXOID公司产品）定性检测流感嗜血杆菌的β内酰胺酶菌株。

1.2.4 ESBL检测 CLSI推荐的纸片法筛选和酶抑制剂增强确证试验检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌中产ESBL菌 株。

1.2.5 D试验 葡萄球菌用P639板卡上诱导克林霉素耐药孔进行检测，链球菌用CLSI推荐的红霉素和克林霉素纸片法进行检测。

1.2.6 青霉素不敏感肺炎链球菌（PNSP）检测 直接用青霉素E试验条测定其最低抑菌浓度（MIC），按CLSI 2018年的非脑膜炎和脑膜炎肺炎链球菌标准，分别判定为青霉素敏感（PSSP）、中介（PISP）或耐药（PRSP）株。

1.2.7 耐万古霉素肠球菌（VRE）检测 对万古霉素纸片法测定为不敏感菌株者，进行菌种复核、并用万古霉素E试验条测定确认MIC值。利奈唑胺和替考拉宁不敏感的肠球菌也分别用E试验进行确认。

1.2.8 耐药菌的定义 广泛耐药（XDR）菌株指对除黏菌素和替加环素外的其他抗菌药物全耐药者[1]。碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（CRE）指对亚胺培南、美罗培南或厄他培南任一种耐药者[2]。

1.2.9 药敏试验结果判读和数据分析 按CLSI 2018年版标准判读药敏试验结果[3]，其中磷霉素的判断标准仅针对尿标本分离的大肠埃希菌和粪肠球菌，替加环素的判断标准按美国FDA文件标准[4]，对鲍曼不动杆菌的判断标准按Jones等[5]2007年发表的文献，纸片扩散法抑菌环直径≥16 mm为敏感、13～15 mm为中介，≤12 mm为耐药；微量肉汤稀释法折点为MIC≤2 mg/L为敏感，4 mg/L为中介，≥8 mg/L为耐药。采用WHONET 5.6版统计软件分析数据。

2 结果

2.1 菌种分布

9 627株非重复细菌，革兰阴性菌占68.9%.6 636.9 627 ），革兰阳性菌占31.1 %（2 991/9 627）。分离前十位的细菌为：大肠埃希菌（18.4%）、铜绿假单胞菌（12.2%）、肺炎克雷伯菌（12.1%）、鲍曼不动杆菌（9.0%）、金黄色葡萄球菌（7.9%）、粪肠球菌（5.8%）、B群链球菌（5.7%）、CNS（3.9%）、屎肠球菌（3.5%）、阴沟肠杆菌（2.9%）。见表1。

表1 2018年北京协和医院分离细菌菌种分布Table.Distribution of bacterial species in Peking Union Medical College Hospital during 2018

9 627株非重复细菌的科室分布：3 523株（36.6%）分离自门、急诊患者，分离前5位的细菌为大肠埃希菌、B群链球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌。6 104株（63.4%）分离自住院患者，分离前5位的细菌为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌。

9 627株细菌的标本来源：32.8%菌株分离自呼吸道，17.3%菌株分离自尿液，11.9%菌株分离自伤口脓液，10.8%菌株分离自血液，0.6%菌株分离自脑脊液，26.6%菌株分离自其他标本。

2.2 革兰阳性球菌对抗菌药物的敏感率和耐药率

2.2.1 葡萄球菌属 金黄色葡萄球菌和CNS中均未发现对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺耐药菌株。MRSA和MRCNS检出率分别为17.1%（130/761）和69.1%（259/375），耐药率显著高于MSSA和MSCNS。MRCNS对氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类和甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率高于MRSA。除万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺外，MRSA对甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药率低，为3.4%，MRCNS对利福平耐药率低，为10.5%。克林霉素诱导耐药菌株在葡萄球菌属中的检出率为23.9%（271/1136），在金黄色葡萄球菌和CNS的检出率分别为24.6%（187/761）和22.4%（84/375）。见表2。

2.2.2 肠球菌属 971株肠球菌属细菌中粪肠球菌和屎肠球菌的占比为57.9%（562/971）和34.9%（339/971）。粪肠球菌中1株利奈唑胺耐药（8 mg/L）、1株万古霉素耐药（256 mg/L）、1株万古霉素（16 mg/L）和替考拉宁同时中介；屎肠球菌1株利奈唑胺中介（4 mg/L），3株万古霉素耐药（256 mg/L），1株万古霉素（16 mg/L）和替考拉宁同时中介；利奈唑胺、万古霉素不敏感的肠球菌均通过E试验进行确证，替考拉宁用纸片扩散法进行确证。粪肠球菌对青霉素、氨苄西林、高浓度庆大霉素等多数抗菌药物（氯霉素除外）的耐药率显著低于屎肠球菌。尿液分离的粪肠球菌对磷霉素和呋喃妥因的耐药率分别为 4.7%和 0.8%。见表3。

2.2.3 链球菌属 链球菌未发现对万古霉素和利奈唑胺耐药株。青霉素体外药敏结果均为E试验的结果，链球菌属细菌872株；其中β溶血链球菌614株，α溶血链球菌134株。95株肺炎链球菌中只有1株分离于脑脊液标本，且为PRSP，94株非脑膜炎株中有13株PNSP，其中PISP 9株和PRSP 4株。肺炎链球菌对红霉素、阿奇霉素和克林霉素的耐药率较高，均＞90%，仅1株克林霉素诱导耐药菌株。从血液及其他无菌体液分离到134株草绿色链球菌，对头孢菌素类大多敏感，细菌耐药率低，≤5.2%。614株β溶血链球菌中A 群链球菌（化脓链球菌）59株，B群链球菌（无乳链球菌）553株，其他β溶血链球菌2株。A群和B群链球菌对青霉素、氨苄西林和头孢菌素类抗菌药物亦大多敏感，4株PNSP的B群链球菌均进行了菌种的再鉴定和药敏试验的复测；对红霉素和克林霉素的耐药率较高，为64.0%～82.8%。β溶血链球菌克林霉素诱导耐药菌22株均为B群链球菌，占B群链球菌的4.0%。见表 4。

表2 葡萄球菌属对抗菌药物的耐药率和敏感率 Table.Susceptibility of Staphylococcus isolates to antimicrobial agents（%）

表3.粪肠球菌和屎肠球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table.Susceptibility of Enterococcus species to antimicrobial agents（%）

2.3 革兰阴性杆菌对抗菌药物的敏感率和耐药率

2.3.1 肠杆菌科细菌 肠杆菌科细菌对替加环素、 碳青霉烯类和阿米卡星的耐药率最低（≤6.2%）；对酶抑制剂复合剂中氨苄西林-舒巴坦的耐药率相对较高，对其他药物除沙雷菌属外，耐药率均在13.3%以下；对环丙沙星的耐药率略高于左氧氟沙星。克雷伯菌属对碳青霉烯类的耐药率（11.8%～12.3%）高于大肠埃希菌（0.8%～1.5%）。大肠埃希菌、克雷伯菌属细菌（肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌）和奇异变形杆菌中ESBL的检出率分别为49.7 %（881/1 774）、30.6 %（384/1253） 和31.5 %（53/168）；CRE的检出率为5.6%（218/3868）；218株CRE中肺炎克雷伯菌（CRKP）68.8%、大肠埃希菌（CRECO）11.5%和阴沟肠杆菌（CRECL）7.8%。肺炎克雷伯菌中对替加环素耐药37株，且全部为XDR菌株。尿液标本分离的大肠埃希菌对磷霉素的耐药率低，为5.6%。见表 5。

2.3.2 不发酵糖革兰阴性杆菌 鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中X.R 株检出率为21.4 %（186/869）和1.3 %（15/1176）。鲍曼不动杆菌对替加环素、米诺环素和头孢哌酮-舒巴坦的耐药率较低，分别为4.8%、18.3%和30.9%，对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为77.8%和77.2%，对替加环素不敏感的菌株均通过MTS确证。铜绿假

单胞菌对阿米卡星的耐药率最低为3.2%，对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为19.4%和14.3%。嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌体外药敏对所测试抗菌药物的耐药率均较低，分别≤5.6%和≤10.0%。见表6。

表4 成人非脑膜炎肺炎链球菌、α和β溶血链球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table.Susceptibility of non-meningitis S.pneumoniae isolates from adults，alpha and beta-hemolytic Streptococcus strains to antimicrobial agents （%）

表5 肠杆菌科细菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table.Susceptibility of Enterobacteriaceae to antimicrobial agents（%）

表5 （续）Table 5（continued）（%）

表6 不发酵糖革兰阴性杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table.Susceptibility of non-fermentative gram-negative bacilli to antimicrobial agents （%）

2.3.3 流感嗜血杆菌 124株流感嗜血杆菌中115株分离自成人，对氨苄西林的耐药率为53.1%，β内酰胺酶的产酶率为24.3 %（28/115）。见表7。

表7 流感嗜血杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table.Susceptibility of H.influenzae isolates to antimicrobial agents（%）

3 讨论

2018年北京协和医院肠杆菌科细菌、不发酵糖革兰阴性杆菌、葡萄球菌和无乳链球菌体外药敏开始使用商品化VITEK 2-Compact进行，0.9%NaCl液无菌试验和上机药敏菌液纯度的检测对药敏结果准确性非常重要，同时由于各个药敏板卡的局限性，部分菌株和抗菌药物的组合需要用纸片扩散法或E试验等进行确认，当CRE、PNSP、VRE、利奈唑胺和替考拉宁不敏感的肠球菌属等重要或少见的耐药表型出现时也需进行复核验证。由于替加环素体外药敏结果受多种因素的影响[6]，本实验室采用纸片扩散法和VITEK 2-Compact同时检测，若出现任一方法替加环素中介或耐药结果时，用MTS进行确证，MTS试验类似于E试验，与金标准的微量肉汤稀释法结果一致性最高。

2018年细菌分离总数9 627株比2017年.515株有所增加。MRSA的检出率为17.1%，主要分布于内科、急诊和外科，与2017年（25.6%）相比继续下降[7]，也明显低于2017年CHINET的监测结果（35.3%）[8]。此可能与医院持续在医务人员中开展注意手卫生和消毒隔离以及抗菌药物合理应用等教育、第三代头孢菌素和喹诺酮类抗菌药物使用量下降等有关[9]。粪肠球菌和屎肠球菌对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺不敏感的8株（含万古霉素和替考拉宁交叉耐药菌株）均采用万古霉素和利奈唑胺E试验（替考拉宁用纸片扩散法）进行确证，菌株数量相比2017年明显增加，2017年仅在屎肠球菌中分离出4株万古霉素耐药的菌株[7]，其中3株与替考拉宁交叉耐药。其原因和耐药机制需进一步研究。B群链球菌主要分离自阴道拭子和尿液，93%分离自女性，育龄期女性占86.4%（445/515）。CLSI M100不建议对B群链球菌常规进行药敏试验，但考虑到部分患者可能对青霉素过敏，需要用红霉素或克林霉素进行治疗，所以本院还是常规对其进行体外药敏试验，B群链球菌对红霉素和克林霉素的耐药率较高（73.5%和64.0%），对青霉素、头孢菌素类、万古霉素和利奈唑胺保持高度敏感（99.3%～100%）。与2017年相比，成人流感嗜血杆菌株对氨苄西林的耐药率（53.1% 对38.8%）和β内酰胺酶阳性率（24.3 %对17.2%）均有明显上升[7]，可能为β内酰胺酶阴性氨苄西林耐药（BLNAR）菌株或其他耐药机制可能导致了对氨苄西林的耐药，使用头孢硝噻吩纸片进行β内酰胺酶检测时一定要注意缓慢阳性的菌株（放置1 h后观察结果为阳性）。

产ESBL大肠埃希菌、克雷伯菌属（肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌）和奇异变形杆菌的检出率分别为49.7%、30.6 %和31.5%，与2017年（47.6%、27.6%和33.0%）大致相仿[7]。CRE检出率为5.6%，继2013－2016年CRE检出率逐年上升（2.1%～5.3%）[10]，2017年（3.8%）有所下降之后2018年再次上升[7]。CRE主要分离于ICU和急诊患者，标本主要来自呼吸道、尿液和血液。克雷伯菌属是CRE中最常见的分离菌，2018年肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率（12.4%和12.5%）较2017年（8.5%和8.2%）有所上升[7]。这提示需要加强碳青霉烯类抗菌药物的使用管理，做好隔离等措施。多黏菌素和替加环素被认为是治疗CRE 所致感染最有效的抗菌药物，但已有对两种药物耐药的报道[11-12]，需要三种或更多种药物的联合治疗[13]。CRE对替加环素的耐药率为5.6%，比2017年4.9%有所上升[7]，替加环素纸片扩散法的假耐药率比较高[14]，推测可能纸片法折点的设定与MIC结果没有保持一致有关，故纸片法结果显示不敏感菌株需要用MTS方法进行确证，体外比较便捷且与微量肉汤稀释法一致性最高[6]。鲍曼不动杆菌替加环素不敏感菌株达35.0%，相关耐药机制主要与外排泵系统相关[15]。多黏菌素的体外药敏纸片扩散法和商品化方法均不可靠，需要进行微量肉汤稀释法进行确证，目前已有的也仅是流行病学界值（ECV），只能报告野生型和非野生型，且仅适用于大肠埃希菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌和解鸟氨酸拉乌尔菌[3]。磷霉素的体外抗菌活性易受培养基中葡萄糖和（或）磷酸盐的干扰而减弱，加入少量6-磷酸-葡萄糖（G-6-P）则可增强本品的作用。推荐纸片扩散法（200 μg磷霉素纸片中含有50 μg G-6-P）或琼脂稀释法（琼脂中加入25 mg/L的G-6-P），CLSI中磷霉素仅针对尿液中大肠埃希菌和粪肠球菌有折点，体外药敏结果对这两种菌有很好的抗菌活性，敏感率分别为93.6%和92.2%，但较2017年有所降低（95.8%和97.4%）[7]。有研究指出磷霉素对CRE等多重耐药和XDR菌有效，可以降低其他药物的毒性，并减缓耐药菌株出现的进程，适用于尿路感染、前列腺炎和慢性肺炎等疾病[16]。

鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌XDR株的检出率及对亚胺培南和美罗培南的耐药率与2017年相比均有所上升[7]，这类菌株主要分离于ICU和急诊患者，标本主要来自呼吸道和血液。手卫生、环境的清洁、患者的隔离仍是医院感染控制的基础。联合多黏菌素治疗鲍曼不动杆菌是主要的治疗方案，但目前治疗效果不佳，亟需研发一些新型抗菌药物[17]。铜绿假单胞菌对阿米卡星的耐药率最低（3.2%），黏液型铜绿假单胞菌多引起囊性纤维化、支气管扩张等慢性肺部感染，体外药敏试验结果显示一般较敏感，但需要联合大环内酯类药物共同治疗[18]，一定注意做好备注，引起临床关注。