稻田养殖的大鳞副泥鳅出血病病原菌的分离鉴定与药敏试验

雷 坤，谢业扬，马远雄，王邦杰，范道周，陆专灵，徐娣美，何有柯，韦友传

(1.广西大学动物科学技术学院，南宁 530000； 2.广西壮族自治区水产科学研究院，广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，南宁 530000)

鱼类出血病又称为细菌性败血症、爆发性出血病，主要病症为鱼体各器官组织充血、出血，可造成鱼类全身性出血甚至死亡[1]。研究表明嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonassobria)和维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、寄生虫等多种病原都可导致鱼类发生出血病病害[2-8]。

大鳞副泥鳅(Paramisgurnusdabryanus)属鲤形目鳅科花鳅亚科副泥鳅属，广泛分布于东亚地区，为小型淡水底栖鱼类。因其味道鲜美、肉质细嫩、营养丰富被誉为“水中人参”[9]，已成为稻田养殖的主要鱼类。2018年7月广西那坡县念头村稻田养殖的大鳞副泥鳅发生出血病病害，病鱼表现为离群、行动迟缓、精神不振、不摄食，躯干两侧、鳍基部皮肤出血、肿胀；解剖结果显示腹腔内积水，胃部内无食物，后肾、肝脏不同程度出血。病程持续3周，死亡率达70%，给养殖户造成重大经济损失。目前关于稻田养殖的大鳞副泥鳅出血病病害还未见报道。本研究应用病原微生物分离技术、回归感染实验、生理生化鉴定、16S rDNA克隆测序和生物信息学等方法分离鉴定大鳞副泥鳅出血病病原、分析病原的致病性、测定病原药物敏感性，以期为防控稻田养殖的大鳞副泥鳅出血病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

患病大鳞副泥鳅体质量(14.2±5.2)g，来自广西百色市那坡县某稻田养殖场。健康大鳞副泥鳅400条，体质量(22.6±8.3)g由广西水产科学研究院那马基地赠送，实验室水族箱暂养两周，水温(26±2)℃，每天喂食1次商品颗粒饲料，确认健康状态良好后用于回归感染实验。普通营养琼脂培养基购自北京奥博星生物科技有限责任公司；水解酪蛋白琼脂(MH)和兔血营养琼脂平板购自北京陆桥技术有限责任公司。药敏纸片和细菌生化微量鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)和细菌基因组DNA提取试剂盒购自艾德莱生物科技有限公司。引物合成和16S rDNA测序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 病原菌分离

无菌条件下，从患病大鳞副泥鳅病灶部位(体表、肝脏、后肾)取样，划线接种于普通营养琼脂培养基，30 ℃培养16 h，挑选单个优势菌落再次划线培养，两次纯化后挑取单个菌落转接到斜面普通营养琼脂培养基保种备用。

1.3 回归感染实验

取斜面琼脂培养基中的保种菌株接种于普通LB液体培养基，30 ℃恒温震荡过夜，采用平板菌落计数法计算菌液浓度。用PBS制备浓度为5×102、5×103、5×104、5×105、5×106、5×107、5×108、5×109、5×1010、5×1011CFU/mL菌悬液，PBS作为对照组。采用腹腔注射法，注射剂量为0.1 mL/条，每组20条。注射后饲养于水族箱，实验期间正常投喂，观察两周，每天记录实验鱼发病死亡情况。根据实验结果使用SPSS软件计算半致死量LD50。

1.4 生理生化鉴定

取致病菌株分别接种于普通营养琼脂培养基与兔血琼脂培养基，30 ℃培养24 h后观察菌株形态特征及溶血性。革兰氏染色后，显微镜下观察其形态特征。用细菌生化微量鉴定管对致病菌进行生理生化鉴定。

1.5 16S rDNA分子鉴定

参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取病原菌基因组DNA。16S rDNA PCR扩增所需通用引物分别为：上游引物F1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物R1：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系：ddH2O 8.5 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL。PCR产物经0.15%琼脂糖凝胶电泳检测并回收纯化，PCR回收产物连接至pTOPO-T载体，转化入感受态细胞TOP10，挑选阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.6 序列比对以及进化树构建

使用SeqMan软件进行测序结果拼接。使用在线软件BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行同源基因的搜索、DNAstar软件进行同源性分析、MEGA5.0软件以及邻接法构建N-J系统进化树(设定bootstraps为1 000)。

1.7 药敏试验

药敏试验采用K-B纸片扩散法[10]。即以涂布法接种扩大培养后的致病菌菌液(2×108CFU/mL)到MH固体培养基，然后将药敏纸片贴在培养基上，30 ℃培养18～24 h后测定抑菌圈直径(mm)。

2 结果与分析

2.1 回归感染实验

从病灶部位体表、肝脏和后肾组织分别分离得到一株优势菌，命名为DLFNQ-1、DLFNQ-2、DLFNQ-3。人工感染实验结果发现DLFNQ-2、DLFNQ-3各梯度菌液对大鳞副泥鳅不具致病性；DLFNQ-1对大鳞副泥鳅具有致病性。DLFNQ-1致死率为0%的最大菌悬液浓度为5×104CFU/mL，致死率为100%的最小菌悬液浓度为5×1010CFU/mL；其中5×105、5×106、5×107、5×108、5×109CFU/mL 菌悬液组2周内死亡数分别为4、7、11、14、17只。使用SPSS软件中的分析-回归-Probit功能计算DLFNQ-1的LD50为2.3×107CFU/mL。

回归感染注射DLFNQ-1菌悬液后部分试验鱼体表粘液消失，继而肿胀出血，解剖结果显示腹腔内少量积水，肝脏与后肾出血，与自然发病的大鳞副泥鳅症状一致；对感染鱼进行细菌再分离得到菌落形态单一的菌落，生化鉴定结果与DLFNQ-1一致。PBS对照组大鳞副泥鳅未出现死亡情况，也无任何病症出现，活力与正常个体无差别。

2.2 生理生化鉴定结果

DLFNQ-1在普通营养琼脂平板上生长状况良好，菌落表面光滑、圆整、微微凸起、无色或淡黄色，菌落半透明且具有芳香气味，直径1.5～2 mm，革兰氏染色结果显示其为阴性短杆状，两端钝圆(图1)。在兔血营养琼脂平板上形成β溶血环。DLFNQ-1的葡萄糖、阿拉伯糖、氧化酶、七叶灵反应均为阳性；柠檬酸、尿素酶、MR等反应均为阴性(表1)初步鉴定DLFNQ-1菌株为嗜水气单胞菌。对感染鱼进行致病菌再分离得到一优势菌株，其菌落形态特征、革兰氏染色结果以及生理生化特性与DLFNQ-1一致。

2.3 16SrDNA基因序列分析

以分离得到的DLFNQ-1菌株基因组DNA为模板，扩增16S rDNA序列。PCR产物经电泳显示单一条带。PCR产物经胶回收连接转化，挑选菌液阳性克隆送至生工生物工程有限公司进行测序，测序结果显示DLFNQ-1菌株的16S rDNA序列长度为1 509 bp(图2)，序列已提交GenBank(登录号：MK142306)。在线工具进行BLAST分析，结果显示其与嗜水气单胞菌(登录号：JN391411.1)的相似度高达99.7%。

项目DLFNQ-1嗜水气单胞菌葡萄糖++果糖++麦芽糖++纤维二糖--阿拉伯糖++蔗糖++甘露糖++半乳糖++伏普++吲哚++氧化酶++硝酸钾++精氨酸双水解++柠檬酸--赖氨酸脱羧酶++七叶灵++尿素酶--已二酸--甲基红--

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

2.4 进化树构建

选择GenBank中气单胞菌科(Aeromonas)、弧菌科(Vibrionaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)共计12个标准菌株的16S rDNA基因序列，使用MEGA5软件以邻近法构建(Bootstrap值为1 000)DLFNQ-1菌株16SrDNA基因的N-J进化树。结果显示DLFNQ-1菌株16S rDNA序列与嗜水气单胞菌聚为一支，具有较高的Bootstrap值(图3)。结合细菌形态特征和生理生化鉴定结果，确定DLFNQ-1为嗜水气单胞菌。

图2 DLFNQ-1的16S rDNA PCR产物电泳图Fig.2 PCR amplification results of 16S rDNA gene of the DLFNQ-1

2.5 药敏试验结果

病原菌DLFNQ-1对17种抗生素的药敏试验结果见表2。该菌株对庆大霉素、妥布霉高度敏感，对阿洛西林、哌拉西林、卡那霉素、新霉素、链霉素等中度敏感，对青霉素、左氟沙星、阿莫西林等呈现一定程度的耐药性。

图3 菌株DLFNQ-1的16S rDNA序列的系统发育进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences from DLFNQ-1，and other related bacteria 发育树上的Bootstrap值为1 000，菌株DLFNQ-1用(◆)表示。

表2 病原菌DLFNQ-1的药敏实验结果Tab.2 The drug sensitivity test of the DLFNQ-1

注：抑菌圈直径包括药敏片直径，S：高度敏感，I：中度敏感，R：不敏感

3 讨论

嗜水气单胞菌隶属气单胞菌科气单胞菌属，在淡水、污水及土壤中广泛分布。可感染多种动物，如大鲵(Andrias)[11]、黄鳝(Monopterusalbus)[12]、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[13]、胡子鲶(Clariasfuscus)[14]、斑点叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)[15]、牛蛙(Lithobatescatesbeiana)[16]，在蚌科[17]、蟹类[18]中也有嗜水气单胞菌引起病害的报道；其感染人类导致腹泻发生[19]。本研究从稻田养殖的患出血病大鳞副泥鳅中分离获得嗜水气单胞菌，回归感染实验证实其对健康大鳞副泥鳅具有致病性。这与前人报道的嗜水气单胞菌对水产动物具有致病性相一致。但是引起泥鳅出血病的细菌存在多样性：维氏气单胞菌可导致泥鳅下颌腹部发红，肝脏脾脏出血[5]；温和气单胞菌可导致泥鳅体表呈点状出血，腹部肿胀[6]；豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)可导致泥鳅体表表皮剥落进而在这些部位出现血斑，并且肠道有出血症状[20]。本次分离得到的嗜水气单胞菌引起大鳞副泥鳅体表、鳍基部皮肤肿胀出血，后肾、肝脏不同程度出血，与上述气单胞菌引起泥鳅出血病的病症表现并不完全一致，可能是嗜水气单胞菌与其它气单胞菌不同的致病机制导致的，具体原因有待进一步研究。

本研究分离得到的嗜水气单胞菌半致死浓度为2.3×107CFU/mL，也有研究显示嗜水气单胞菌对健康加州鲈(Micropterussalmoides)的半数致死剂量为5.7×105CFU/mL[2]；嗜水气单胞菌浓度达到5×104CFU/mL 时黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)死亡率在40%～50%[21]；嗜水气单胞菌对黄河鲤(Cyprinuscarpio)的半致死浓度为1.38×107CFU/mL[22]。表明不同的水生动物对嗜水气单胞菌具有不同的毒力耐受性。嗜水气单胞菌为条件性致病菌，其致病性会因环境改变而有所不同，因此嗜水气单胞菌对大鳞副泥鳅半致死浓度还可能与稻田养殖的环境有关。

目前抗生素类药物仍然是治疗水生动物病害的主要手段。对DLFNQ-1菌株的药敏实验结果与李焕荣等[23]、杨宁等[24]和余波等[11]报道的嗜水气单胞菌药敏试验结果不完全一致。其原因可能是感染不同物种的嗜水气单胞菌因感染对象和环境的不同而产生变异；也可能是不同物种的嗜水气单胞菌对抗生素类药物产生了不同程度的耐药性[25-26]。结合本次实验，稻田养殖大鳞副泥鳅出血病的防治建议使用对嗜水气单胞菌高度敏感的庆大霉素或妥布霉素。此外，在稻田养殖过程中应注意减少不合理操作对鱼体表的创伤、适当投喂营养全面的饲料以及合理的换水，增强大鳞副泥鳅免疫力，从而减少病害的发生。