子宫内膜息肉不孕症患者增殖期与种植窗期子宫内膜组织VEGF、Ki-67表达变化

冯苗，韩立薇，吴穗妹，李玉华，李蕾蕾，李艳秋，张碧云

(广东省计划生育专科医院，广州510600)

子宫内膜息肉(EP)是一种常见的宫腔内良性病变，是引起不孕症的常见原因之一。有研究报道，16.5%～26.5%的不明原因性不孕症患者合并EP[1]。近年来，随着超声技术不断发展和宫腔镜广泛应用，EP的检出率越来越高。不孕症患者助孕前常规行宫腔镜检查，EP的检出率高达23.6%[2]。目前，EP的病因和发病机制尚不完全清楚，普遍认为与雌孕激素受体失调、炎症刺激、氧化应激、细胞因子表达异常及细胞增殖与凋亡失调等有关[3]。血管内皮生长因子(VEGF)是一种作用于血管内皮细胞的细胞因子，具有促进内皮细胞增殖、分化，增加微血管通透性及诱导血管生成等作用，是判断种植窗期子宫内膜容受性的生物标志物之一。Ki-67是一种与细胞增殖相关的核抗原。有研究报道，VEGF、Ki-67异常表达与绝经后妇女EP形成和术后复发有关。但在育龄期EP不孕症患者增殖期与种植窗期子宫内膜组织中VEGF、Ki-67表达的报道较少。为此，本研究观察了育龄期EP不孕症患者增殖期与种植窗期子宫内膜组织VEGF、Ki-67表达变化，旨在探索VEGF、Ki-67异常表达与EP形成和术后复发及子宫内膜容受性的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年4～12月在广东省计划生育专科医院就诊的、因不孕症行宫腔镜检查发现宫腔内赘生物并经病理证实为EP患者84例(观察组)，其中初发63例、复发21例，年龄20～35(30.3±3.5)岁，不孕年限1～12(4.7±3.1)年。所有患者经全面检查排除输卵管、子宫畸形，内分泌、免疫系统疾病及男方因素等导致的不孕症。同期选择在广东省计划生育专科医院就诊的，因男方因素所致的不孕症，宫腔镜检查未发现宫腔内赘生物且病理证实为正常子宫内膜者43例(对照组)，年龄20～40(31.3±3.9)岁，不孕年限1～10(5.6±3.3)年。两组年龄、不孕年限具有可比性。本研究经广东省计划生育专科医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 VEGF、Ki-67表达检测 观察组入院后行宫腔镜检查，其中处于增殖期62例(复发21例均处于增殖期)、种植窗期22例，留取EP组织、EP周围0.5～1.0 cm肉眼观察无异常子宫内膜组织(以下称周围组织)；对照组入院后亦行宫腔镜检查，其中处于增殖期23例、种植窗期20例，留取正常子宫内膜组织(以下称正常组织)。

所有组织10%中性甲醛固定，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。切片经59 ℃电热恒温干燥箱过夜，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，3% H2O2室温孵育5～10 min以灭活内源性过氧化物酶，微波加热修复抗原。5%正常山羊血清封闭10～15 min，分别加入鼠抗人VEGF单克隆抗体、兔抗人Ki-67多克隆抗体，4 ℃湿盒中孵育过夜。次日，加入生物素化二抗，37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性的乳腺癌组织作为阳性对照。

采用双盲法由两位病理科医师独立阅片。VEGF阳性染色定位于细胞质，呈浅黄色至棕褐色颗粒；Ki-67阳性染色定位于细胞核，呈浅黄色至棕褐色颗粒。每张切片随机选取10个400倍视野，评估染色强度；计数每视野阳性细胞，计算阳性细胞比例。染色强度评分：未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞比例评分：无阳性细胞为0分，<5%为1分，5%～<50%为2分，50%～<70%为3分，≥70%为4分。以染色强度评分和阳性细胞比例评分综合评价，二者之和≥3分为VEGF或Ki-67阳性表达[4]。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验或Fisher精确概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组增殖期VEGF、Ki-67阳性表达比较 见表1。

表1 两组增殖期VEGF、Ki-67阳性表达比较[例(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05；与同发病状态周围组织比较，#P<0.05。

2.2 两组种植窗期VEGF、Ki-67阳性表达比较 见表2。

表2 两组种植窗期VEGF、Ki-67阳性表达比较[例(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

EP是子宫内膜基底层的局限性良性增生，有蒂突向宫腔，由少量致密纤维结缔组织组成的间质、管壁较厚的血管及子宫内膜腺体组成，好发于育龄期或围绝经期妇女，是引起育龄期妇女不孕症的常见原因之一[5，6]。目前，临床治疗通常采用宫腔镜电切术。EP切除后不仅能提高育龄期不孕症患者自然妊娠率，还能改善辅助生殖技术助孕的育龄期不孕症患者妊娠结局，但术后复发率高达13.3%[7]。众所周知，子宫内膜在正常月经周期中经历增殖、分化、脱落的周期性变化，而EP组织同正常子宫内膜一样也存在周期性变化。因此推测，EP在宫腔内占位机械性干扰胚胎着床并造成子宫内膜微环境改变，有可能是导致EP不孕的重要原因[6，8]。

VEGF是血小板生长因子超家族的重要成员之一，是目前已知作用最强的促血管生成因子，能直接作用于血管内皮细胞，通过与其特异性受体结合，促进血管内皮细胞增殖并增加其通透性，介导血管内皮细胞迁移和浸润，从而有利于血管形成[9]。VEGF在月经周期各时期子宫内膜中均有表达，对内膜血管生成和血管通透性改变及月经来潮后内膜再生至关重要。在增殖期，子宫内膜上皮细胞表达的VEGF主要作用于间质，可促进内皮细胞增殖、新生血管形成。在分泌期，子宫内膜VEGF表达增加，可使内膜微血管密度和血管通透性增加，内膜间质明显水肿，为胚胎着床提供了必需的条件。在增殖期，对照组子宫内膜组织VEGF弱阳性表达，有利于血管生成，从而促进月经后的内膜修复；观察组无论是初发还是复发EP组织VEGF阳性表达均明显高于周围组织和对照组，EP组织VEGF过表达引起组织内新生血管过度生成并伴有间质纤维组织增加，显微镜下可见成束或成索的大血管，这是EP组织区别于正常子宫内膜组织的一个重要特征[10]；复发EP组织VEGF阳性表达明显高于初发EP组织，VEGF高表达反映了血管内皮细胞增殖、迁徙和血管构建水平高，这可能是导致EP复发的原因之一。VEGF作为判断子宫内膜容受性的生物学标志之一，能为种植提供血管化的容受性。在种植窗期，对照组子宫内膜组织VEGF阳性表达增加，有助于胚胎着床和早期绒毛血管形成；观察组EP组织及周围组织VEGF阳性表达均明显低于对照组，其阳性表达降低可能与子宫内膜下血流灌注减少，从而影响子宫内膜容受性有关[11]，最终导致胚胎着床失败，继而引起不孕[12]。

Ki-67是一种与细胞增殖相关的核抗原，定位于人10号染色体，其功能与有丝分裂密切相关[13]。Ki-67反映细胞增殖活性的效果要明显优于PCNA指数、DNA指数、DNA倍体含量等指标。Ki-67在增生期子宫内膜组织中弱表达，而在分泌期子宫内膜组织中几乎不表达。有研究证实，Ki-67过表达在子宫内膜病变的发生、发展中具有重要作用。对照组增殖期子宫内膜组织Ki-67弱表达，表明处于活跃的增生状态，有利于子宫内膜修复和再生[14]；观察组无论是初发EP组织还是复发EP组织Ki-67阳性表达均明显高于周围组织和对照组；而种植窗期，两组子宫内膜组织几乎无Ki-67阳性表达，从而限制了子宫内膜增生，有利于子宫内膜的周期性脱落。这些结果表明，Ki-67高表达可能与EP的形成及术后复发有关，Ki-67表达增加是细胞增殖活性和有丝分裂增强的标志，提示EP是一种细胞增殖性疾病，腺体细胞和间质细胞有丝分裂增强，有更多的细胞进入增殖周期，但局限于EP内，并不是组织失控性增生[15]，故在育龄妇女中起源于EP的子宫内膜癌非常少见。EP病理组织学常见的是单纯性或复杂性增生，伴或不伴整个子宫内膜增生[16]。

综上所述，EP不孕症患者增殖期EP组织VEGF、Ki-67高表达可能与EP形成和术后复发有关，而种植窗期EP组织VEGF低表达可能与子宫内膜容受性欠佳有关。这一结论有可能为EP不孕症患者治疗方案选择乃至研发治疗EP的靶向药物提供理论依据。