黄芩提取物对嗜水气单胞菌抑菌活性和机制的研究

王 意， 张博涵， 陆一鸣， 周 欣， 王 骁，王柳妍， 贺小贤， 刘 欢

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)是一种条件致病菌，主要存在于海水、淡水、河流、湖泊等水环境以及污泥、土壤、人类粪便中，是我国淡水水产养殖鱼类爆发性细菌疾病的主要病原菌[1]，可以感染草鱼、鲤鱼、鲫鱼以及罗非鱼等多种水产养殖鱼类.此外，嗜水气单胞菌还可以感染人类，能引发人类的中耳炎、败血症及创伤面感染、腹膜炎以及急性肠胃炎等疾病的发生[2].在国外，嗜水气单胞菌已经被列入食品卫生检验的对象和医院腹痛腹泻病原菌检测的一项内容.因此，嗜水气单胞菌相关疾病的爆发不仅给水产养殖业造成巨大损失，还直接对人类健康造成威胁，受到水产、医学界的重视[3].

目前，我国对于嗜水气单胞菌病害的防治主要采用抗生素方法，长期使用抗生素，不仅会破坏畜禽的胃肠道微生态平衡、干扰其免疫系统、降低其对疾病的抵抗力，威胁畜牧业的可持续发展，而且会造成药物残留，威胁食品安全以及人类健康[4].因此，开发高效安全的新型抑菌剂成为亟待解决的问题.

中草药是天然物质，安全可靠，毒副作用小，由于其抗菌作用的广泛性和协同性而不易出现抗药性，弥补了饲用抗生素的缺点.我国具有丰富的中草药资源，目前，中草药提取物已成为饲用抗生素替代品研究的热点[5].而关于中草药对嗜水气单胞菌抑菌效果的研究已有报道.

例如，郭秀平等[6]进行了45种中草药水提物对中华鳖源嗜水气单胞菌的体外抑菌作用研究，结果表明夏枯草、诃子、牡丹皮、地榆、黄芩、赤芍效果最佳，其次为黄莲、大黄、连翘、乌梅、大青叶、丁香.赵蓓蓓等[7]进行了10种常见中草药水提物对嗜水气单胞菌ZHYYZ-1的体外抑菌效果研究，发现五倍子、金银花、黄芩、蒲公英的抑菌效果明显强于连翘、黄连、鱼腥草、穿心莲、大青叶和板蓝根.

陶健等[8]研究了16种中草药及5种复方制剂对4株嗜水气单胞菌的体外抑菌作用，结果发现黄芩、诃子以及复方制剂三黄汤对嗜水气单胞菌AH2和AH32的抑菌效果最好；诃子对嗜水气单胞菌AH15抑菌效果最佳，而黄芩对AH15无抑菌效果；黄芩和诃子对嗜水气单胞菌AH43抑菌作用最明显.张其中[9]进行了不同中草药对嗜水气单胞菌的体外抑菌试验，结果发现：五倍子、诃子、黄连能有效抑制嗜水气单胞菌，而黄芩、连翘、平贝等则无明显的抑菌效果.可见，不同中草药对嗜水气单胞菌体外抑菌效果不尽相同，同一种中草药对嗜水气单胞菌不同菌株的抑菌作用也相差甚远.

因此，针对本实验室所分离的嗜水气单胞菌致病株开展中草药抑菌活性的研究是必要的.此外，关于中草药对嗜水气单胞菌的抑菌研究主要集中在体外抑菌效果上，而对于其内在的抑菌机制尚未开展深入研究.同时，对于不同提取方法对中草药抑菌效果的影响研究也较少.

本实验选取四种常见中草药黄芩、乌梅、野菊花、凤尾草为原料，分别采取水提法和醇提法制备其水提物和醇提物，比较不同提取方法下中草药对嗜水气单胞菌抑菌作用的影响，选取抑菌效果良好提取物，通过二倍稀释法确定其最小抑菌浓度，进一步地通过对菌体培养液的电导率、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)及蛋白质含量等的测定，从细胞膜及细胞壁完整性等方面深入研究其对抑菌机理，旨在为开发安全高效的新型抗菌药物提供理论指导.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 中草药原料

黄芩、乌梅、野菊花、凤尾草，四种中草药均购自西安同仁大药堂.

1.1.2 受试菌种

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)由本实验室提供.

1.1.3 主要试剂与仪器设备

LB培养基，1%NaCl，1%蛋白胨，0.5%酵母粉；碱性磷酸酶试剂盒，购于碧云天生物技术公司.

HH系列数显恒温水浴锅(金坛市科析仪器有限公司)，YWF-300生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司；UV290紫外可见分光光度计(舜宇恒平有限公司)；LE204E/02电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；ZX-100电热鼓风干燥器(上海一恒科学仪器有限公司)；GT10-1高速离心机(上海精科天美科学仪器有限公司)；SHB-3循环水式多用真空汞(郑州长城科工贸有限公司)；FW-200高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；THZ-C-1全温振荡器(太原培英仪器制造有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 嗜水气单胞菌菌悬液的制备

嗜水气单胞菌：在已灭菌的含5 mL LB培养基血清瓶中按1%的接种量接种活化后的嗜水气单胞菌，在恒温摇床中30 ℃下震荡(200 rpm)培养13 h.采用平板计数法计数，用液体培养基稀释菌液至1×107CFU/mL，置4 ℃冰箱中保存备用.

1.2.2 中草药提取物的制备

分别采用水提法和醇提法[10,11]对四种中草药进行提取物原液(1 mg/mL)的制备.水提法：以黄芩水提物为例，称取黄芩粉末10 g，加入100 mL蒸馏水，使料液比为1∶10，浸泡2 h后超声处理30 min，随后先用武火加热10 min，再保持文火煎煮30 min，四层纱布过滤收集一煎药液，药渣重新加入100 mL蒸馏水，武火加热10 min，文火煎煮30 min，过滤掉残渣收集二煎药液，合并两次药液后3 000 rpm离心10 min，取其上清液加热浓缩至10 mL，调节pH值至7.2,4 ℃保存备用.醇提法：以黄芩醇提物为例，称取黄芩粉末10 g，加入五倍量的50%乙醇溶液，料液比为1∶6，浸泡24 h后用60 ℃恒温水浴锅热浸3 h，四层纱布过滤收集药液，将药渣再加入五倍量的50%乙醇溶液热浸3 h，过滤掉残渣，合并两次所得的醇浸液，4 500 rpm下离心10 min取其上清液，浓缩至原液浓度为1 g/mL，调节pH值至7.2,4 ℃保存备用.

1.2.3 不同中草药提取物抑菌活性的测定

采用滤纸片平皿扩散法[12].即取200μL已活化好的嗜水气单胞菌悬液，均匀涂布于培养基，将高压灭菌处理过的滤纸片(直径为6 mm)浸蘸不同中草药提取物原液并紧贴于培养皿表面，每板等距离放置三个做平行实验，空白提取物作为对照组，置于30 ℃恒温生化培养箱中培养12至18 h，观察是否具有透明抑菌圈，用游标卡尺测量其直径，取平均值，记录数据.

1.2.4 黄芩提取物最低抑菌浓度的测定

采用二倍稀释法[13].将黄芩提取物原液(1 g/mL)稀释配成50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.563%六种浓度梯度.取200μL已活化的菌悬液均匀涂布于平板，每个平板等距离放置浸蘸了不同浓度梯度提取物的滤纸片，根据稀释度从高到低的顺序，先将6个浓度的药液分为两组，每组是3个相连的浓度，第四个滤纸片用无菌水作空白对照组，将制作好的培养皿放入4 ℃冰箱中冷藏3 h，待药液完全扩散到琼脂层后将培其放入37 ℃恒温生化培养箱中过夜培养12～18 h，观察嗜水气单胞菌的生长情况，以确定不同浓度梯度的黄芩水提物对其的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)记录数据.

1.2.5 黄芩水提物对嗜水气单胞菌细胞膜的影响

(1)黄芩水提物对菌体培养液电导率的影响

将嗜水气单胞菌活化培养至对数期(4～6 h)，按1%的接种量接种到添加0.5 MIC、1 MIC和2 MIC黄芩水提物的液体培养基中，置于恒温摇床中培养[14]，以不加黄芩水提物的液体培养基作为空白对照，每隔两小时取样，直至八小时，转速为3 500 rpm下离心10 min，取上清液用紫外分光光度计在450 nm波长下测其电导率，实验至少重复3次.

(2)黄芩水提物对菌体培养液总漏出率的影响

嗜水气单胞菌处理步骤同1.2.5中(1)所述.用紫外分光光度计在600 nm波长下测上清液的吸光值[15]，实验至少重复3次.

1.2.6 黄芩水提物对嗜水气单胞菌菌细胞壁的影响

嗜水气单胞菌处理步骤同1.2.5中(1)所述.用碱性磷酸酶试剂盒分别测定加入不同浓度黄芩水提物的菌悬液上清中的AKP含量，实验至少重复3次[16].

1.2.7 黄芩水提物对嗜水气单胞菌菌蛋白质含量的影响

嗜水气单胞菌处理步骤同1.2.5中(1)所述.取上清液用考马斯亮蓝法测定胞外蛋白质质量浓度，实验至少重复3次[17].

2 结果与讨论

2.1 不同中草药提取物对嗜水气单胞菌抑菌活性的测定

2.1.1 不同中草药水提物原液对嗜水气单胞菌的抑菌作用

由表1可以看到，四种不同种类的中草药水提物对嗜水气单胞菌均具有抑菌作用，抑菌性大小排序为：黄芩水提物>野菊花水提物>乌梅水提物>凤尾草水提物，黄芩水提物抑菌性效果最好.

表1 不同中草药水提物原液对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径(mm)

注：b表示p<0.01.

2.1.2 不同中草药醇提物原液对嗜水气单胞菌的抑菌作用

由表2可以看到，四种不同种类的中草药醇提物对嗜水气单胞菌也具有一定抑菌作用，抑菌性大小排序为：黄芩醇提物>乌梅醇提物>野菊花醇提物=凤尾草醇提物.

表2 不同中草药醇提物原液对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径(mm)

注：b表示p<0.01.

综上结果可知，所选取的四种中草药中，黄芩提取物原液对嗜水气单胞菌的抑菌效果最为显著，因此，选取黄芩提取物进行后续MIC的测定及抑菌机制的研究.

2.2 黄芩提取物对嗜水气单胞菌最小抑菌浓度的测定

对抑菌效果最好的黄芩水提物进行嗜水气单胞菌MIC的测定.由表3、表4得出：不同浓度的黄芩水提物对嗜水气单胞菌的抑菌效果呈现一定的浓度依赖性，即抑菌效果与黄芩水提物的浓度正相关；黄芩水提物浓度为0.062 5 g/mL后对嗜水气单胞菌无抑菌效果.黄芩水提物对嗜水气单胞菌的MIC为0.125 g/mL.

表3 不同浓度的黄芩水提物对嗜水气单胞菌抑菌圈直径(mm)

表4 黄芩水提物的最低抑菌浓度

注：“-”表示无菌落生长，“+”表示有菌落生长，AH代表嗜水气单胞菌

2.3 不同浓度的黄芩醇提物对嗜水气单胞菌的抑菌作用

对黄芩醇提物进行二倍稀释，测定不同浓度黄芩醇提物对嗜水气单胞菌的抑菌效果，确定最小抑菌浓度.由表5，表6可以得出：不同浓度的黄芩醇提物对嗜水气单胞菌的抑菌效果呈现一定的浓度依赖性，即抑菌效果与黄芩水提物的浓度正相关.黄芩醇提物对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度为0.25 g/mL.比较黄芩水提物和醇提物的抑菌效果得知，黄芩水提物抑菌效果较好，故本实验后期选取黄芩水提物来研究其抑菌机制.

表5 不同浓度的黄芩醇取物对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径(mm)

表6 黄芩醇提物的最低抑菌浓度

注：“-”表示无菌落生长，“+”表示有菌落生长

2.4 黄芩水提物对嗜水气单胞菌细胞膜的影响

2.4.1 黄芩水提物对菌体培养液电导率的影响

不同浓度黄芩水提物作用于嗜水气单胞菌后，菌体培养液的电导率变化如图1所示.结果显示，未添加黄芩水提物的对照组中，菌体培养液电导率在培养时间内基本保持恒定；而在添加不同浓度黄芩水提物后，嗜水气单胞菌培养液的电导率相较对照组增大，且随药液浓度的增加和处理时间的延长而升高.

图1 黄芩水提物对嗜水气单胞菌电导率的影响

2.4.2 黄芩水提物对嗜水气单胞菌培养液总漏出率的影响

黄芩水提物作用于嗜水气单胞菌后菌体培养液的总漏出率的变化如图2所示.由图2可知，未加药液处理的对照组中，嗜水气单胞菌培养液总漏出率在整个培养过程中始终与培养初期基本保持一致，未出现明显变化；而添加了不同浓度黄芩水提物后，总漏出率较对照组显著增加，且呈现出明显的浓度依赖性，同时，菌体培养液的总漏出率呈现出时间正相关性.当药液浓度为2MIC时，总漏出率在6 h时达到最大值，之后有所下降.

图2 黄芩水提物对嗜水气单胞菌总漏出率的影响

研究表明，中草药是通过多靶点机制抑制致病菌生长或杀死致病菌，常见的靶点包括菌体的细胞膜、细胞壁、核酸、酶等，而抑菌机制包括破坏胞壁和胞膜结构.郑翠萍等[18]研究发现茜草丙酮提取物通过降解细胞壁或细胞膜中的酶，使膜通透性提高影响枯草芽孢杆菌的生长繁殖.Yong等[19]证明紫珠叶、野牡丹、半枝莲3种植物提取物通过破坏大肠杆菌与铜绿假单胞菌的细胞膜通透性与完整性而起到抑菌作用.侯伟峰等[20]与谢晶等[21]分别研究了植酸对大肠杆菌与腐败希瓦氏菌的作用机制，结果得出其对2种菌的MIC分别为0.4%、0.2%，植酸主要通过破坏菌体细胞壁与细胞膜的完整性使细胞质外渗，达到杀灭菌目的.本实验数据表明黄芩水提物可破坏菌体细胞膜的完整性，造成细胞内离子及小分子物质外漏，即黄芩水提物可通过破坏嗜水气单胞菌细胞膜完整性和通透性实现抑菌作用.

2.5 黄芩水提物对嗜水气单胞菌细胞壁的影响

AKP是位于细胞壁与细胞膜之间的一种酶，在细胞结构完整时胞外含量极低.而当细胞壁受损后，AKP将大量泄漏到胞外，作为判断细胞壁完整性的指标.黄芩水提物作用于嗜水气单胞菌后AKP含量变化如图3所示.未经处理的对照组，菌液中的AKP含量约为1 U/L，且在整个培养周期中没有发生明显变化.而添加了不同浓度的黄芩水提物后，菌液中AKP含量均明显增高，且随着药液浓度的增高而增高，同时随着作用时间的延长亦增加.当作用时间到达6 h后，AKP含量基本趋于稳定.

图3 黄芩水提物对嗜水气单胞菌菌液碱性磷酸酶含量的影响

研究表明，中草药可抑制细胞壁黏肽生成，增加其通透性使内容物外泄；谢丽玲等[22]发现黄芩醇提物破坏副溶血性弧菌细胞壁而使其裂解死亡.Zhou等[23]发现樟树叶提取出的松脂醇可破坏铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌的细胞膜和细胞壁，使可溶性糖和蛋白质泄漏而抑制其生长.

由图3可见嗜水气单胞菌悬液的AKP值在不同黄芩水提物处理后均明显增加，说明黄芩水提物对嗜水气单胞菌的细胞壁可产生一定破坏作用，使AKP渗出，导致菌悬液中的AKP含量增加；这与前述电导率的实验结果一致.

2.6 黄芩水提物对嗜水气单胞菌胞外蛋白质含量的影响

黄芩水提物作用于嗜水气单胞菌后对胞外蛋白含量的影响曲线如图4所示.可以发现，未经任何处理的对照组中，菌体培养液上清中的胞外蛋白质含量较低，约为0.5 mg/mL，且随着培养时间的推移未出现明显变化.而当在培养基中添加了不同浓度的黄芩水提物后，嗜水气单胞菌胞外蛋白含量较对照组显著增加，且随着培养时间的延长，胞外蛋白含量随之增加，同时还呈现一定的浓度依赖性，即所添加的黄芩水提物浓度越高，胞外蛋白含量越高.结果进一步表明黄芩水提物可能破坏了菌体细胞膜和细胞壁的完整性，导致胞内蛋白外漏，使得胞外蛋白含量增加.也可能直接影响蛋白质合成，从而影响遗传物质合成(包括DNA的复制、RNA的转录).此外，中草药还可抑制细菌相关酶活性及外排泵的功能；抑制细菌的呼吸代谢等来实现抑菌作用.

图4 黄芩水提物对嗜水气单胞菌蛋白质含量的影响

3 结论

嗜水气单胞菌作为一种水产养殖的重要病原菌，不仅直接影响我国水产养殖业的发展，还可以通过食用水产品威胁到人类健康.目前，对于嗜水气单胞菌病害的防治主要采用传统抗生素的手段，但抗生素的长期使用甚至滥用，导致了水产品药物残留严重超标，长此以往，使得水产养殖病原菌产生耐药性.

我国中草药资源丰富，种类繁多.中草药提取物为天然物质，毒副作用下，不易出现耐药性.本文选取黄芩、乌梅、野菊花、凤尾草作为研究对象，分别采用水提法和醇提法进行了提取物的制备，采用滤纸片平皿扩散法测定其对嗜水气单胞菌的抑菌活性，发现四种中草药提取物均具有较好的抑菌活性，其中黄芩提取物抑菌效果最为显著，确定黄芩水提物MIC为0.125 g/mL，醇提物MIC为0.25 g/mL，并选取黄芩水提物进行了抑菌机制的初步探讨.

从细胞膜、细胞壁、蛋白质含量对黄芩水提物对嗜水气单胞菌的抑菌机制进行了初探，结果发现经过黄芩水提物处理后，嗜水气单胞菌培养液电导率和总漏出率均升高，而电导率和总漏出率可以作为检测细胞膜完整性的指标，试验结果表明黄芩水提物能够影响嗜水气单胞菌的细胞膜通透性，使胞内离子等内容物外流，破坏细胞膜的完整性.碱性磷酸酶和蛋白质含量均增加，表明黄芩水提物破坏了嗜水气单胞菌细胞壁的完整性.本文结果表明黄芩水提物对于嗜水气单胞菌的抑菌作用主要通过作用于细胞膜、细胞壁等靶点实现，对于开发新型安全的抗菌药物具有重要的理论指导价值.