航天器AIT中心空气霉菌特性研究

1. 航天神舟生物科技集团有限公司，北京 100190 2. 北京市空间生物工程技术研究中心，北京 100190 3. 中国航天科技集团有限公司 空间生物工程研究中心，北京 100190

微生物污染是进行长期载人航天活动面临的一个严重问题，已经有多起航天器的微生物污染事件发生。和平号空间站在运行期间曾发生多次由微生物导致的设备故障。舷窗曾因霉菌的生长造成能见度降低，光学性能下降，氧气电解装置因真菌的繁殖而出现堵塞，温控系统管道被真菌繁殖形成的胶状物质堵塞引发故障[1-2]。在国际空间站的运行期间，也曾多次报道发生微生物污染事件。俄罗斯舱的一个烟感器曾因真菌对电子部件的降解引发故障，在美国发生渗漏的搭载储水设备(Payload Water Reservoir (PWR))上发生真菌污染[3-4]。另外一项在空间站上俄罗斯舱段进行的关于空间站材料微损伤早期症状调查研究发现，在30处发生材料微损伤的地点中，有一半以上是由微生物污染引起[5]。因此，为保障航天器系统的长期运行安全，微生物防护与控制是航天器系统工程中的一项重要工作。

航天器的微生物防护与控制必须从控制微生物的来源，杜绝适宜微生物生长的环境，清除滋生的微生物，监测微生物生长情况，研究微生物的演变与应对措施等几个方面形成闭环控制[6]。在微生物来源方面，现有的研究结果显示航天器总装厂房是航天器携带微生物的重要环境来源之一。尽管厂房有严格的清洁要求且环境(干燥、缺乏营养物质等)极度不利于微生物的生长繁殖，但由于往来人员货物较多，仍有大量的微生物在飞船组装厂房中被发现[7-8];且地面厂房中的微生物种类及数量要远多于飞行器[9]，因此对厂房中微生物的监测和微生物生理生化特性研究,可以有效了解航天器的潜在微生物污染情况，并为微生物防护控制提供指导。欧美等国制定了一系列的标准方法和程序，用于航天器装配环境和硬件设备的微生物监测、控制和防护[2]。对于航天器洁净间内的微生物，NASA和ESA等主要利用培养法、ATP法、分子法等方法进行总量和多样性等方面的研究，建立微生物数据库[7-8]。同时对分离出的微生物进行生理特性方面的研究，主要包括微生物对干燥、氧化剂、紫外辐射、温度、盐浓度、pH值等方面的耐受性研究，为航天器装配环境和硬件设备的微生物防护控制提供科学参考[10]。目前针对我国航天器AIT(总装、集成和测试)厂房微生物的研究已有报道。文献[11]基于培养法对我国AIT中心空气微生物进行了分析，文献[12]利用高通量测序技术分析对我国某航天器AIT中心空气微生物组成与多样性进行了研究。目前这些研究仅对AIT厂房微生物群落特征进行了研究，但对各微生物的生理生化特征研究还未见报道。

本研究通过对中国3个地区的航天器AIT厂房多次进行空气微生物采集，利用传统培养法获得53株霉菌菌株。通过ITS(internal transcribed spacer)测序法将所有真菌鉴定到属水平，进一步结合β-tubulin基因片段测序将大部分样品鉴定到种水平。通过对霉菌菌株的菌落径向生长速率和消毒剂敏感性测试，对AIT厂房空气霉菌生理生化特征有了更深入的了解，为日后菌种库的构建和厂房与航天器的微生物防护控制提供依据。

1 材料和方法

1.1 AIT厂房空气采样

在中国3个地区的航天器AIT厂房进行空气采样。使用SAS空气微生物采样器(VWR-PBI)采集空气样品1 000 L(流速180 L/min)。采样器中装有沙氏培养基(SDA，蛋白胨10 g/L、葡萄糖40 g/L、琼脂20 g/L)用于收集空气中的真菌。

1.2 菌株纯化培养与形态观察

SDA平板进行30℃、72 h培养后，将平板上的真菌分别挑取到新的SDA培养基上划线涂板，直到得到单菌落。将纯化得到的单菌落重新划线涂板培养(30℃、72 h)后，置于4℃保存备用。将纯化培养得到的单菌落接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，马铃薯浸粉3.0 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂14 g/L)平板上，30℃培养4天后观察菌落形态，主要记录菌落颜色、边缘形态、底部颜色、孢子数量等。

1.3 霉菌种属鉴定

PDA平板上刮取少量霉菌菌丝体和孢子，采用MP公司FastDNATM SPIN Kit for Soil试剂盒提取各霉菌样品的基因组DNA。利用引物ITS1/ITS4 PCR扩增各霉菌样品DNA的ITS区，测序后与GenBank序列比对进行霉菌属水平鉴定。利用引物btub1/btub2 PCR扩增曲霉属benA基因片段[13]，引物Bt2a/Bt2b PCR扩增青霉属、枝孢霉属、踝节霉属和轮枝霉属β-tubulin基因片段，测序后与GenBank序列比对进行种水平鉴定[14]。PCR扩增体系为25 μl，扩增条件为：94℃，2 min；94℃，30 s；58℃，30 s；72℃，30 s；30个循环；72℃，5 min。PCR扩增引物序列如表1所示。

表1 PCR基因扩增引物序列

1.4 菌落径向生长测试

各霉菌样品接种到PDA平板上，30℃培养7天后收集孢子，制备孢子悬液，调整孢子液浓度至106/ml，取10 μl接种到PDA平板中心位置，30℃培养，第3天开始测量菌落直径，直至第7天。每个样品3个平行。

1.5 消毒剂敏感性测试

使用聚六亚甲基双胍(polyhexamethylene biguanide简称PHMB，胍类消毒剂)和4250Z(复合季铵盐类消毒剂，包含25%烷基二甲基氯化铵C14 60%，C16 30%，C12 5%，C18 5%，25%烷基二甲基苄基氯化铵C12 68%，C14 32%)两种消毒剂对鉴定后得到的53株霉菌进行消毒剂最低抑菌浓度(MIC)测试。实验方法基于CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)的孔板稀释法[15]。培养基使用马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB，马铃薯浸粉5.0 g/L、葡萄糖15 g/L、蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L)，霉菌孢子液浓度为106/ml。PHMB浓度(ppm)梯度设为2.5、5、10、20、40、80、160、320、640、1 280；4 250Z浓度(ppm)梯度为2.5、5、10、20、40、80、160、320。阳性对照孔不含消毒剂，阴性对照孔为培养基PDB。进行3次重复实验。

2 结果

2.1 霉菌分离与鉴定

三个航天器AIT厂房空气霉菌的形态特征、种属鉴定结果及对人体或材料潜在危害如表2所示。分离鉴定得到53株霉菌，其中青霉属(Penicillium sp)13株、曲霉属(Aspergillus sp)23株、枝孢霉属(Cladosporium sp)7株、踝节菌属(Talaromyces sp)6株、派仑霉属(Peyronellaea sp)1株、轮枝霉属(Lecanicillium sp)1株、链格孢属(Alternaria sp)1株和共头霉属(Syncephalastrum sp)1株。通过扩增ITS和β-tubulin基因片段测序相结合进行的种水平鉴定结果发现青霉属和曲霉属内的全部菌株可以鉴定到种水平，青霉属内包括草酸青霉、产红青霉、橘青霉等7个种，曲霉属内包括土曲霉、烟曲霉、构巢曲霉等11个种。但枝孢霉属和踝节菌属的部分菌株未能鉴定到种水平。

表2 形态特征和种属鉴定结果

续表2

注：N表示未鉴定到种

2.2 菌落径向生长测定

53株霉菌菌落径向生长曲线如图1所示。结果显示：

1)曲霉属内菌株径向生长直径范围较宽，第7天直径范围为22～84 mm(图1b)。其中烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、塔宾曲霉、溜曲霉径向生长直径较大，第7天直径范围为81～85 mm；构巢曲霉、土曲霉、赤曲霉径向生长直径一般，第7天直径范围为54～75 mm；杂色曲霉、聚多曲霉、田纳西曲霉径向生长直径较小，第7天直径范围为22～41 mm。

2)青霉属内菌株径向生长直径范围亦较宽，第7天直径范围为23～75 mm(图1a)。其中草酸青霉、绳状青霉、意大利青霉径向生长直径一般，第7天直径范围为45～75 mm；而产黄青霉、产红青霉和瘿青霉径向生长直径较小，第7天直径范围为23～37 mm。

3)枝孢霉属和踝节菌属内菌株径向生长直径均比较小，第7天直径范围为16～33 mm(图1c、d)。

4)另有4个属只有单株菌，其中轮枝霉属菌株径向生长直径较小，第7天直径为36 mm(图1d)；派伦霉属菌株和链格孢属菌株径向生长直径一般，第7天直径约为70 mm；共头属菌株径向生长直径最大，第7天直径大于90 mm(图1d)。

图1 菌落径向生长测定结果Fig.1 Radial growth measurement results

2.3 消毒剂敏感性

53株霉菌对PHMB和4250Z两种消毒剂的MIC结果如表3所示。结果显示大部分霉菌对复合季铵盐类消毒剂4250Z均敏感，所有霉菌MIC4250均不超过80 ppm，说明较低浓度的4250Z即可很好的抑制霉菌生长。

而不同霉菌对双胍类消毒剂PHMB敏感差异非常大：1)轮枝霉属菌对PHMB极不敏感，MICPHMB已经大于1280 ppm。2)曲霉属中的烟曲霉、溜曲霉、黄曲霉对PHMB不敏感，MICPHMB大于320 ppm；杂色曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、赤曲霉、田纳西曲霉、聚多曲霉对PHMB敏感，MICPHMB小于20 ppm。3)青霉属中的橘青霉对PHMB不敏感，MICPHMB为640 ppm，而其他青霉则较为敏感，MICPHMB小于80 ppm，绳状青霉和瘿青霉最为敏感，MICPHMB仅为5 ppm。4)枝孢霉属内绝大部菌株对PHMB均敏感，MIC值小于10 ppm，只有一株对PHMB的MIC值为160 ppm。5)共头霉属菌株、链格孢属菌株、派伦霉属菌株和踝节菌属内各菌株均对PHMB较为敏感，MICPHMB小于80 ppm。

表3 消毒剂最低抑菌浓度

续表3

注：N表示未鉴定到种

3 分析

航天器AIT厂房内微生物种属鉴定是载人航天工程中微生物防控的重要环节，对评估微生物对航天器材料和宇航员潜在风险具有重要意义，同时为航天器清洁和灭菌方法的研究和应用提供指导。欧美等主要利用培养法或分子法对航天器洁净厂房内微生物多样性和丰度进行监测[16-17]。基于培养法的微生物检测技术简单实用、稳定可靠，是可以确定微生物存活和能否繁殖扩增的检测方法，因此是航天器厂房内微生物检测的必要方法[16]。培养法的微生物检测技术首先分离纯化菌株，进一步利用DNA测序技术进行种属鉴定。目前在真菌种属鉴定方面主要利用ITS测序法。真菌ITS区是位于核糖体DNA(rDNA)上18S 和28S 基因之间的区域片段，主要包括内转录间隔区1(ITS1)、5.8S rDNA、内转录间隔区2(ITS2)，长度一般在650～750 bp之间[18]。通过PCR扩增真菌ITS区再与数据库进行比对的方法已经可以将真菌鉴定到属的水平，少数真菌可以鉴定到种的水平。

本研究中分离纯化的53株霉菌利用ITS测序法全部可以鉴定到属的水平。在真菌种水平鉴定方面，对于曲霉属和青霉属的研究报道较多，而其他属的报道较少。Janet F. Staab等利用PCR-RFLP检测发现曲霉属β-tubulin基因(benA)内含子区种内差异相对保守，而具有较高的种间差异，因此benA基因(btub1/btub2)可以用于曲霉属鉴定[13]。朱敏等利用ITS序列分析和β-tubulin基因序列分析法鉴定曲霉属菌株发现β-tubulin基因序列分析曲霉的分辨率较ITS高，可以将曲霉准确鉴定到种，ITS序列可以分析到曲霉复合种[19]。N. Louise Glass 等针对histone3、histone4 、β-tubulin和ATPase设计了五对引物用于丝状子囊菌(Filamentous Asconmycetes)鉴定[13]，Kazuo Satoh等利用其中的Bt2a/Bt2b引物扩增β-tubulin基因用于青霉属种水平鉴定[20]。本研究通过扩增ITS和β-tubulin基因片段测序相结合进行的种水平鉴定结果显示23株曲霉属菌株和13株青霉属菌株全部可以鉴定到种水平。本研究还尝试了β-tubulin基因在枝孢霉属、踝节霉属和轮枝霉属菌株种水平的鉴定，结果显示7株枝孢霉属菌中有5株可以鉴定到种水平，6株踝节菌属菌株只有1株鉴定到种水平，由此可见β-tubulin基因片段在这些真菌属内菌株种水平的鉴定并不太合适，需要进一步的研究。

利用传统培养法得到纯化菌株53株，通过ITS和β-tubulin基因片段测序鉴定发现分属8个属，其中青霉属和曲霉属菌株居多，而青霉属和曲霉属菌株多对材料有腐蚀作用[21-22]。如黑曲霉可以在聚合材料、金属材料、泡沫等许多材料上大量生长，土曲霉可以侵蚀帆布、纸板、塑料等，黄曲霉对皮革、织物造成影响，绳状青霉可以侵蚀许多材料尤其是纺织品，杂色曲霉、橘青霉和产黄青霉可以影响光学仪器等等。而航天器应用的材料复杂多样，有很多容易被霉菌腐蚀，因此这些霉菌会威胁到航天器系统的长期运行安全。霉菌除对大量材料有腐蚀危险外，部分霉菌还对人体有潜在危害，包括感染、毒性和过敏反应等。尽管大部分霉菌对免疫系统健康人群没有危险，但大量研究显示很多宇航员的免疫系统受空间飞行影响[23-24]。由于空间飞行相关因素引起免疫系统的大部分指标发生变化，通常是降低[25]，而霉菌感染通常会在免疫力低下情况时发生，因此防控这些霉菌种属对保障宇航员健康是非常必要的。本研究中亦检出了多种条件致病菌(表2)，如引发曲霉病的烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉和聚多曲霉[26-27]。霉菌除引起感染外，很多霉菌还会产生真菌毒素和过敏原，能够影响免疫系统和其他器官。例如黄曲霉会产生黄曲霉毒素，一种致癌物[28]。产黄青霉能够产生毒素引起发炎、细胞毒性反应[29]，橘青霉的橘青霉素可引起肾小球损害[30]。

微生物的生长曲线可以明确微生物的生长规律，本研究利用PDA平板法测定了53株霉菌的径向生长曲线，结果显示不同种属霉菌生长速率差异非常大——培养到第7天，最小菌落直径只有16 mm(枝孢霉属菌)，最大的菌落直径可以达到90 mm(共头霉属菌)。综合比较各属之间生长差异发现轮枝霉属、枝孢霉属和踝节菌属菌株一般生长较慢，派伦霉属菌株和链格孢属菌株生长较快，共头霉属菌株生长最快。青霉属和曲霉属的属内不同种间菌株生长差异较大，但大部分生长较快。曲霉属内的杂色曲霉生长最慢，黑曲霉生长最快；青霉属内的产黄青霉生长最慢，草酸青霉生长较快。对于生长速度快，同时对材料或人体具有潜在危险的霉菌需要特别注意防护控制，如黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、绳状青霉、草酸青霉、共头霉属菌等，这些霉菌一旦开始繁殖，会迅速扩增，会对材料或人体带来较大危害。

航天器的微生物防护与控制是一项复杂的系统工程，在航天器设计、地面建造和在轨飞行等阶段都需要进行严格的微生物控制。消毒剂作为一种有效的微生物控制措施，在国外已经应用于航天器微生物防控的多个阶段[7]。例如制定航天器装配车间例行的清洁消毒规程；在国际空间站美国舱段，每周会安排4 h进行清洁，使用一种便携式吸尘器，6种消毒湿巾对舱内环境进行清洁消毒。由于消毒剂具有相应的抗菌谱，对不同微生物的抗性效果差异较大，因此消毒剂对航天器厂房内微生物的抗菌性研究对于航天器消毒剂的选择具有重要意义。

本研究进行了4250Z和PHMB两种消毒对航天器AIT厂房内53株霉菌的抗菌性(MIC)研究。消毒剂4250Z属于季铵盐消毒剂，由4种烷基二甲基苄基氯化铵和2种烷基二甲基乙基苄基氯化铵混合制成，NASA曾将其用于空间站表面清洁[31]。季铵盐为铵离子中四个氢原子都被烃基取代而生成的化合物，其中的有机根和氮离子结合成1价阳离子集团，可吸附于微生物表面，形成离子微团，穿透细胞壁并与细胞膜结合，深入类脂层和蛋白层，改变细胞膜的通透性，使细胞内容物泄露，蛋白质、核酸降解，导致微生物死亡[32]。本研究结果显示4250Z对霉菌具有非常广的抗菌性，对枝孢霉属、曲霉属、青霉属、踝节菌属、派伦霉属、轮枝霉属、链格孢属和共头霉属都有抗性，并且这些种属菌株对4250Z都很敏感，MIC4250均不超过80 ppm，由此说明较低浓度的4250Z即可很好的抑制这些霉菌的生长，是一种理想的消毒剂。本研究使用的另一种消毒剂是双胍类消毒剂PHMB，是一种新型、高效、多用途的高分子聚合物，具有广谱低毒、抑菌浓度低，易溶于水，水溶液无色无味，不燃不爆等特性，有极强的杀灭细菌和病毒的能力[33]。研究发现PHMB通过带正电荷的双胍集团吸附在带负电荷的细菌表面，与磷脂双分子层相互作用，破坏膜结构与细菌染色体结合并将其浓缩形成纳米级颗粒，最终导致细菌死亡[34]。目前认为PHMB对真菌具有广谱抗菌性[35]，本研究结果亦显示PHMB对霉菌具有较广的抗菌性，对枝孢霉属、链格孢属、共头霉属、派伦霉属、踝节菌属和大部分青霉属和曲霉属菌株都有抗性，但对轮枝霉属菌的抗性极差。

消毒剂具有相应的抗菌谱，对不同微生物的抗菌性可能差异较大，本研究仅对厂房内部分霉菌进行了两种消毒剂的抗菌性(MIC)检测，结果表明受试的霉菌对双胍类消毒剂PHMB敏感差异非常大，而对复合季铵盐类消毒剂4250Z都较为敏感，相比较而言，消毒剂4250Z可能较为适合本研究AIT总装厂房所分离鉴定出真菌的消毒应用。但由于本研究仅对部分空气霉菌进行了试验，还有大量其他霉菌以及细菌，特别是芽孢等耐受性强的微生物需要更广泛深入的试验。 同时在消毒剂的选择应用时还需要考虑到消毒剂的安全性，如消毒剂的挥发性、残留问题等，这些都将加剧航天器微生物污染与防护控制的难度。

4 结束语

通过对中国3个地区的航天器AIT厂房内空气中霉菌进行采集，利用培养法微生物检测技术鉴定出53株霉菌，分属8个属。其中检出多种对人体有潜在危险的条件致病菌和对材料具有腐蚀作用的霉菌，如黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、绳状青霉、草酸青霉、共头霉属菌等。这些霉菌生长速度又比较快，一旦开始繁殖，会迅速扩增，会对人体和材料带来较大危害，因此在AIT厂房霉菌防护控制工作中需要特别注意防护控制。消毒剂作为一种有效的微生物控制措施，在国外已经应用于航天器微生物防控的多个阶段。本研究进行的消毒剂敏感性研究结果表明AIT厂房内的不同霉菌对双胍类消毒剂PHMB敏感差异非常大，而对复合季铵盐类消毒剂4250Z都较为敏感，这些差异加剧了航天器微生物污染与防护控制的难度。