RP-HPLC测定盐酸氟西汀有关物质的方法学研究

张 婷 郭颖昕 刘彩凤 李德祥

上海上药中西制药有限公司 （上海 201800）

盐酸氟西汀又名百忧解，即（±）-N-甲基-3-苯基-3（4-三氟甲基苯氧基）丙胺盐酸盐（C17H18F3NO·HCl），其化学结构如图1所示。

图1 盐酸氟西汀的化学结构

盐酸氟西汀是一种具有选择性的神经递质抑制剂（SSRI），其对于神经递质 5-羟色胺（5-HT）的存在十分敏感，能够准确地抑制神经元细胞兴奋并从突触间隙中捕捉摄取5-HT，这极有效地增加了间隙中神经递质的数量，继而延长和增加了5-羟色胺的作用，从而达到改善、纠正情感状态，治疗抑郁性精神障碍的目的。盐酸氟西汀的临床疗效与三环类抗抑郁药相当，但不良反应轻微，安全性高，服用方便，深受医生和患者的青睐。

为了进一步控制上海上药中西医制药有限公司产品盐酸氟西汀胶囊的质量，参考国内外相关文献材料，系统地研究分析了盐酸氟西汀有关物质的测定，并采用C8色谱柱、利用反相高效液相色谱建立了盐酸氟西汀有关物质的测定方法。实验结果证实该方法具有良好的专属性、耐用性、稳定性，以及较高的灵敏度，进一步说明该法适用于盐酸氟西汀产品有关物质项的检测。

1 实验部分

1.1 仪器

SOTAX溶出试验仪，香港力扬企业有限公司；AL104电子天平、S20精密pH计，梅特勒-托利多国际贸易有限公司；Agilent 1200，1260型全自动高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.2 试剂

三乙胺、四氢呋喃，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇，色谱纯，赛默飞世尔科技公司；磷酸，分析纯，太仓沪试试剂有限公司。

1.3 标准品

实验过程中所使用的标准品信息如表1所示。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件

用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent Zorbax Eclipse Plus C8，4.6 mm×250mm×5μm 或效能相当的色谱柱）；以三乙胺缓冲溶液（取三乙胺10 mL，加水980 mL，摇匀，加磷酸适量调节pH至6.0，用水稀释到 1000mL）-甲醇-四氢呋喃（体积比为 62∶8∶30 ）为流动相，等度洗脱；洗脱流速为1.0 mL/min；柱温箱温度为25℃；紫外线检测波长为215 nm。

表1 标准品信息

1.4.2 溶液的配制

1.4.2.1 系统适用性溶液的制备

取盐酸氟西汀约22 mg，置于具塞试管中，加0.5 mol/L硫酸溶液10 mL，85℃水浴3 h，放冷，此溶液中含有盐酸氟西汀杂质Ⅰ和杂质Ⅱ；取上述溶液0.4 mL，置于25 mL容量瓶中，分别取盐酸氟西汀约28 mg与杂质Ⅳ对照品约1 mg，置于上述25 mL容量瓶中，加入流动相溶解并稀释到刻度，即得系统适用性溶液。

1.4.2.2 供试品溶液的制备

取本品内容物适量 （约相当于氟西汀50 mg），置于25 mL量瓶中，加入适量流动相，充分振摇并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

1.4.2.3 对照溶液的制备

精密量取5 mL，置于50 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL置于100 mL量瓶中，加入流动相，稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

1.4.2.4 灵敏度溶液的制备

精密量取对照溶液25 mL，置于100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度溶液。

1.4.2.5 测定方法

分别取系统适用性溶液和灵敏度溶液各10μL注入高效液相色谱仪，调节检测灵敏度使主成分峰高的信噪比大于10，并考察分离度。再取对照溶液与供试品溶液10μL，分别注入高效液相色谱仪记录色谱图至主成分峰保留时间的4倍，采用自身对照法计算供试品中杂质含量。

2 结果与讨论

2.1 系统适用性试验

取系统适用性溶液10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果如表3所示。在有关物质色谱条件下，理论板数按氟西汀计为3093，杂质Ⅰ、杂质Ⅳ、氟西汀、杂质Ⅱ峰间的分离度分别为26.12，1.54和22.22，说明该法色谱条件分离效果良好。

表2 盐酸氟西汀有关物质系统适用性试验结果

2.2 检测限（LOD）和定量限（LOQ）试验

精密称取0.0223 g盐酸氟西汀原料置于200 mL量瓶中，加入流动相溶解稀释到刻度，摇匀，作为盐酸氟西汀贮备液。称取约5 mg杂质Ⅳ置于25 mL量瓶中，加入流动相溶解稀释到刻度，摇匀，作为杂质Ⅳ贮备液。继续用流动相稀释成一系列质量浓度的溶液，摇匀，精密量取10μL，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，以主成分峰的峰高与基线噪音的信噪比约为10时的质量浓度为定量限；将定量限质量浓度稀释3倍后，此时仪器的信噪比约为3，为检测限。

表3 盐酸氟西汀有关物质检测限与定量限ng/mL

由表3可以看出，在上述色谱条件下，盐酸氟西汀的检测限为1.003 5 ng/mL，定量限为3.4565 ng/mL，盐酸氟西汀杂质IV的检测限为2.5600 ng/mL，定量限为7.4400 ng/mL。

2.3 专属性试验

通过利用高温、45000 lx照射、氧化、强酸、强碱等严苛条件对供试样品进行加速破坏，以研究可能存在的分解途径及产物，同时考察方法的专属性。

取本品内容物适量，精密称定，置于25 mL量瓶中，加入适量流动相，充分振摇，加入流动相稀释到刻度，摇匀，滤过，取续滤液适量即得未破坏供试品溶液。在上述色谱条件下，精密量取各破坏条件下的溶液10μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果如表4所示。

表4 盐酸氟西汀有关物质专属性试验结果

由表4可知，各破坏条件下产生的杂质极其微量，主峰纯度几乎不受干扰，可见该色谱条件专属性较强。

再取空白辅料适量，采用上述样品专属性试验方法，对空白辅料用45000lx照射、高温、强酸、强碱和氧化进行一系列加速破坏，处理后的样品取10μL续滤液注入液相色谱仪。结果表明，在该条件下，辅料不干扰样品的检查。

2.4 线性试验

2.4.1 盐酸氟西汀

取盐酸氟西汀原料0.0538 g，置于25 mL容量瓶中，用流动相稀释制成一系列质量浓度的溶液，在有关物质色谱条件下，分别精密量取10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，结果如图2所示。根据上述试验结果，在1.7216～6.8864μg/mL范围内，盐酸氟西汀质量浓度与峰面积呈正相关，相关系数R2=0.9998，表明相关性很好。

图2 盐酸氟西汀线性回归曲线

2.4.2. 杂质Ⅳ

精密称取杂质Ⅳ约5 mg，置于20 mL量瓶中，用流动相稀释制成一系列质量浓度的溶液，在有关物质色谱条件下，分别精密量取10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按上述同法进行线性回归，结果如图3所示，其回归方程为y=23018x+2.8238，说明在16～48μg/mL范围内，盐酸氟西汀质量浓度与峰面积线性关系良好。

图3 杂质Ⅳ线性回归曲线图

2.5 溶液稳定性试验

取本品内容物适量(约相当于氟西汀50 mg)，按有关物质测定法制备供试品溶液、对照溶液，在室温条件下分别放置0,4,7,10,13,16,19及22 h，在各时间点分别精密量取10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，观察供试品溶液的稳定性，结果如表5所示。

表5 盐酸氟西汀有关物质溶液稳定性试验结果

由表5可知，不同时间下主峰峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.19%，测定结果没有显著变化，表明供试品溶液在室温条件下22 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验

取本品适量，按上述方法制备供试品溶液以及对照溶液。同法操作6份，按上述方法检查有关物质，经计算，平均杂质总量为0.06%，RSD为8.15%，说明该测定方法具有优异的重复性。

2.7 准确度试验

分别精密称取杂质Ⅳ和盐酸氟西汀工作用对照品各适量，按处方量分别加入辅料；杂质Ⅳ和盐酸氟西汀均设计3个不同的质量浓度（分别为80%、100%、120%），制成每1 mL分别约含杂质Ⅳ32，40，48μg和盐酸氟西汀3.576，4.47，5.364μg的混合溶液。每个质量浓度分别配制3份供试品溶液，按上述方法进行回收率测定。

测定结果为：杂质Ⅳ的平均回收率达到100.22%，RSD为0.2%，盐酸氟西汀的平均回收率达到100.34%，RSD为0.6%。该结果表明该方法的准确度高，也进一步证实了其精确性与可靠性。

2.8 耐用性试验

每次只改变一个色谱条件，取同一批供试品溶液分别精密量取10μg，注入液相色谱仪，记录色谱图以考察本品的耐用性，结果如表6所示。

由实验结果可知，进样流速、流动相体积比、色谱柱品牌等均不影响主药的测定，表明该方法的系统耐用性良好。

表6 盐酸氟西汀有关物质耐用性试验结果

3 结语

以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂[Agilent Zorbax Eclipse Plus C8（4.6 mm×250 mm×5μm）或效能相当的色谱柱]；以三乙胺缓冲溶液-甲醇-四氢呋喃（体积比为 62∶8∶30）作为流动相，建立反相高效液相色谱法对盐酸氟西汀胶囊有关物质进行检测。该法灵敏度高、专属性强、杂质分离效果好、耐用性优异、药物质量浓度与峰面积相关性显著，处方中辅料不干扰两种药物含量的测定，且操作简便、检测迅速、准确度高，适用于盐酸氟西汀有关物质的检测。

参考文献（略）