微生物对含蜡原油的除蜡降黏效果

王卫强, 罗 超, 张海娟， 杜胜男， 李 佳

(辽宁石油化工大学 石油天然气工程学院，辽宁 抚顺113001)

石蜡是一种含有正构烷烃、异构烷烃和环烷烃的复杂混合物[1]。当含蜡原油在开采与运输过程中的温度降至析蜡点时，油流中的蜡组分结晶析出、沉积在输油管壁上，致使管道有效流通面积减小，管道输送能力下降[2]。此外，长期在低温环境下输送含蜡原油会带来管道堵塞的安全隐患[3-5]。微生物清防蜡方法可降低原油蜡含量，减少蜡沉积，提高原油流动性[5]，具有高效环保[6]、作用周期长、成本低等特点[7]，已成为研究热点。尤其随着三次采油技术的迅速发展，依靠传统方法来解决含蜡原油在开采和运输过程中面临的难度和生产成本问题已越来越不能满足要求[8]，从而，促进了微生物清、防蜡技术在含蜡原油开采和运输中的应用。

针对大庆含蜡原油特点，笔者从石油污染的土壤中分离出一株嗜蜡菌，考察了其除蜡降黏效果,测定了其代谢产生的生物表面活性剂种类的性能。

1 实验部分

1.1 原料及试剂

含蜡原油样品来自于大庆油田，蜡质量分数为14.6%，密度为872 kg/m3，在37 ℃条件下表观黏度为2614 mPa·s。液体石蜡，分析纯，天津市致远化学试剂有限公司产品。煤油，分析纯，天津市盛鑫源伟业贸易有限公司产品。

土壤样品为大庆含蜡原油污染土壤。

实验所用培养基有：

Luria-Bertani (LB)培养基(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司产品，分析纯，250 g)：去离子水1000 mL、胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 10 g、pH值7.0±0.2。添加15%琼脂，得到LB固体培养基。

无机盐培养基(国药集团化学试剂有限公司产品，分析纯，500 g)：去离子水1000 mL、K2HPO41 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NH4Cl 1 g、 NaNO31 g、微量元素液10 mL。

微量元素液(国药集团化学试剂有限公司产品，分析纯，100 g)：去离子水1000 mL、MnSO40.01 g、FeSO40.1 g、CaCl·2H2O 0.01 g、ZnSO40.01 g、CuSO4·5H2O 0.01 g、CoCl 0.01 g、H3BO40.01 g、NaMoO40.01 g。

1.2 实验方法

1.2.1 嗜蜡菌的筛选及鉴定

将5 g石油污染土壤加入100 mL无机盐培养基中，并添加0.5 mL液体石蜡，在37 ℃、150 r/min条件下富集培养3 d，然后取1 mL上清液加入新鲜培养基中，待培养基出现浑浊时，再次转接，转接过程中液体石蜡添加量由0.5 mL逐步提升到 5 mL。如此反复转接6次后，将100 μL上清液梯度稀释后涂布于LB固体平板上，放入恒温培养箱中培养，待长出菌落后，挑出单菌落反复划线纯化，分离出嗜蜡菌。将菌株交由上海美吉生物医药科技有限公司进行16SrDNA测序，测序结果在NCBI中进行比对，确定该菌菌属。

1.2.2 菌株最适生长环境的优化

将菌株接种于LB液体培养基中培养至108CFU/mL，以3%接种量接种于100 mL无机盐培养基中，并添加2%石蜡为碳源，在不同温度、pH值、盐含量条件下通过紫外分光光度计(上海科恒实业发展有限公司产品)测定菌株生长曲线。

最适生长温度测定：在31、34、37、40、43 ℃条件下振荡培养，通过紫外分光光度计(波长为600 nm)测定菌液光密度值(OD)。

最适生长pH值测定：用HCl与NaOH将无机盐培养基pH值调为5～9，并测定OD值。

最适生长NaCl含量测定：将无机盐培养基NaCl质量分数调节为0～5%，并测定OD值。

1.2.3 代谢产物——生物表面活性剂的分析

将菌株以3%接种量接种于100 mL无机盐培养基中，并添加2%石蜡为碳源，增设不加菌无机盐培养基为对照，在37 ℃、150 r/min条件下振荡培养7 d。

界面张力测定：将发酵液(即加入菌株培养一定时间后的培养基)离心去除菌体，采用JJ2000B旋转滴界面张力测量仪(上海中晨数字设备有限公司产品)测定发酵液界面张力，并与不加菌的对照组比较。

发酵液乳化性能测定：将实验组发酵液与对照组中的无机盐培养基各取4 mL分别与4 mL液体石蜡混合，采用涡旋混合器高速振荡2 min，在室温下静置24 h后，测量乳化高度，并根据公式(1)计算乳化系数(E24)[9-10]。

(1)

式(1)中：h为乳化层高度，cm；H为混合液体总高度，cm。

排油圈测定：量取60 mL去离子水加入直径为 15 cm 的洁净无菌平皿中，并在平皿中心添加1 mL经油红染色的液体石蜡形成油膜，向油膜中心滴 50 μL 经离心去除菌体的发酵液，观察排油圈的形成情况。

表面活性剂提取及鉴定：将菌株发酵液离心去除菌体，用6 moL的HCl将上清液pH值调为2，4 ℃ 条件下静置12 h，再离心收集沉淀，然后溶于氯仿与甲醇混合液(氯仿/甲醇体积比为2/1)中，过滤后采用旋转蒸发器在40 ℃条件下蒸干有机相，得到生物表面活性剂。将1 mg生物表面活性剂与100 mg KBr混合研磨、压片，通过傅里叶红外光谱仪(美国热电公司产品)在400～4000 cm-1波数范围内检测。

1.2.4 细胞疏水性测定

通过高速离心机(日本HITACHI产品)在10000 r/min条件下将发酵液离心收集菌体，用缓冲液洗涤2次，并用缓冲液将菌体的光密度值(OD1)稀释至0.3～0.6；再将等体积煤油与菌液混合，高速涡旋振荡2 min，静置1 h，同等条件下测定水相(菌液)的OD2，细胞疏水性通过公式(2)进行计算[11]。

细胞疏水性=(1-OD2/OD1)×100%

(2)

1.2.5 菌株降解性能测定

将菌株以3%接菌量接入100 mL无机盐培养基中，加入50 mL大庆含蜡原油，在37 ℃、150 r/min条件下振荡培养7 d后，通过差示扫描量热仪(美国TA梅特勒-利托多公司产品)测定含蜡原油蜡含量、析蜡点、析蜡高峰点等参数变化[12]。收集对照组与实验组的含蜡原油，通过高速冷冻离心机在转速为3000 r/min条件下低速离心脱水后，测量菌株处理前后原油的质量变化。

1.2.6 菌株对蜡晶结构形态影响的测定

取少量低速离心脱水后的油样均匀置于载玻片上，在37 ℃、100倍放大倍数条件下，通过BX-53偏光显微镜(日本奥林巴斯有限公司产品)观察嗜蜡菌处理后蜡晶的结构变化。

1.2.7 菌株对原油流变性影响的测定

将50 mL含蜡原油与100 mL基础培养基混合，以3%接种量将嗜蜡菌接入，并设置不加菌对照组，在37 ℃条件下震荡培养7 d后离心脱水，在不同温度及剪切率条件下通过HAAKE流变仪(上海珩璟科技有限公司产品)对油样黏度进行测量，并绘制黏-温曲线。

2 结果与讨论

2.1 嗜蜡菌的鉴定结果

16SrDNA测序结果在NCBI中比对后，结果表明：嗜蜡菌样品与假单孢菌属同源性达到99%以上，因此可确定该嗜蜡菌为假单孢菌属。

2.2 菌株最适生长环境的优化选择

不同的环境因素可促进或抑制微生物的生长，而微生物清防蜡技术的关键就是确保微生物具有良好的活性强度，最大程度发挥菌种性能。通过测定菌液OD值的大小可以反映出菌株活性强度，OD值越大菌株活性越强，从而优化出菌株最适生长环境。每12 h通过紫外分光光度计测定菌液在不同条件下的OD值，并据此绘制菌株生长曲线，见图1。

从图1可以看出：菌株活性强度随温度的变化呈现出先增加后下降的趋势；当温度较低时，菌体内蛋白活性低，活性强度较弱；而在较高温度下，菌体内活性蛋白功能减弱，菌株生长遭到抑制。为充分发挥菌种性能，确定菌株最适生长温度为37 ℃。

图1 不同温度下菌株的生长曲线Fig.1 Growth curves of strains at different temperatures

图2为不同pH值条件下菌株的生长曲线。从图2可以看出：菌株在pH值为5～9范围内都具有较高活性强度；当培养基pH值为7时，活性强度最高。这表明该菌株最适合在中性环境下生长，并对弱酸或弱碱环境都具有一定适应能力。而为保证菌株较高降解作用，确定菌株最适pH值为7.0。

图2 不同pH值条件下菌株的生长曲线Fig.2 Growth curves of strains with different pH values

不同盐含量会影响细胞渗透压，过高或过低的渗透压均会抑制细菌生长[13]。图3为不同NaCl含量下菌株的生长曲线。从图3可以看出,菌株活性强度随着NaCl含量增加呈现出先增强后减弱趋势，并在NaCl质量分数为1%时活性最强。因此，确定菌株最适NaCl质量分数为1%。

图3 不同盐含量下菌株的生长曲线Fig.3 Growth curves of strains with different salt contentsw(Salt)/%: 0; 1; 2; 3; 4; 5

2.3 代谢产物——生物表面活性剂的分析结果

2.3.1 界面张力测定结果

通过界面张力测量仪测得不加菌对照组溶液的界面张力为78.26 mN/m，而测得加菌发酵液(去除菌体)的界面张力为37.45 mN/m，说明该菌株显著降低了液体界面张力，可促进油、水两相混合，有利于菌株对石蜡的降解。

2.3.2 乳化性能结果

生物表面活性剂的乳化性能是微生物清、防蜡的一个重要指标[14]。乳化作用可形成水包油乳状液，可降低摩擦阻力，还可增大细菌与石蜡的接触面积[15]，促进细菌降解。混合液静置24 h后，发现不加菌对照组无乳化现象产生，而菌株发酵液乳化现象显著，通过测量乳化层高度，并通过公式(1)计算得到菌株乳化系数约为70%。结果表明，该嗜蜡菌具有较强的乳化性能，有利于提高含蜡原油的流动性。

2.3.3 排油圈测定结果

将培养7 d后的发酵液离心去除菌体后进行排油活性测定，发现油膜由中心向四周排挤，形成了一个直径约为9.1 cm的排油圈，如图4所示。这表明该嗜蜡菌能产生较高含量的生物表面活性剂。排油圈直径的大小与生物表面活性剂的活性成正比，嗜蜡菌产生的生物表面活性剂，在增加蜡溶解度方面具有较好促进作用，有利于细菌降解。

2.3.4 生物表面活性剂的提取及鉴定结果

实验菌株代谢产生的生物表面活性剂的光谱图如图5所示。

从图5可以看出：生物表面活性剂在3281.71 cm-1处出现了1个特征峰，是由分子间氢键引起的—NH键伸缩振动；2920.45 cm-1和2852.12 cm-1处的特征峰是脂肪族的—CH键伸缩振动；1668.42 cm-1和1542.54 cm-1处的吸收峰表明存在1个仲酰胺键(—CO—N)；1454.76 cm-1的吸收峰表明此处有CH3基团做不对称形变振动；1062.09 cm-1的吸收峰为C—O—C对称伸缩振动。该生物表面活性剂在400～4000 cm-1波数范围内的吸收峰与脂肽的吸收峰相一致，因此确定为脂肽类物质。结果表明，该嗜蜡菌在降解石蜡过程中可产生脂肽类生物表面活性剂，与Liu、Cheng、Ismail等[16-18]的实验结果相一致。

图4 发酵液排油活性检测照片Fig.4 Test photos of oil displacement activity offermentation broth(a) Oil film morphology of fermentation broth was added to the control group; (b) Oil film morphology of fermentation broth with drop addition

图5 菌株代谢产物生物表面活性剂的傅里叶红外光谱图Fig.5 Fourier transform infrared spectroscopyof strain metabolites

2.4 细胞疏水性分析结果

实验测得经缓冲液稀释菌液的光密度值OD1为0.507；将等体积的煤油与菌液混合后，测得菌液的光密度值OD2为0.397；通过公式(2)计算出细菌的细胞疏水性为21.69%。细胞疏水性与烃类物质的降解有着密切联系，疏水性高的细菌更易附着在疏水性底物上，加快对该物质的降解[19]。结果表明，该菌株具有较强疏水性能，为石蜡降解提供了有利条件。此结果与王靖等[20]的实验结果相一致。

2.5 菌株降解性能分析结果

菌株处理前后含蜡原油的蜡含量、析蜡点、析蜡高峰点测定结果如表1所示。

表1 菌株处理前后含蜡原油蜡含量、析蜡点及析蜡高峰点的变化Table 1 Changes of wax content, wax precipitation point andwax peak point of waxy crude oil before andafter strain treatment

从表1分析得到，含蜡原油在经菌株作用后，其蜡含量、析蜡点、析蜡高峰点及油质量均降低，除蜡率达到43%，析蜡点降低1.27 ℃，析蜡高峰点降低1.19 ℃，原油质量降低3.02 g。石蜡为C16～C28之间的饱和烃。实验结果说明菌株对该区间的烃类物质的降解较为显著。蜡含量的降低，可大幅减少蜡沉积；而析蜡点及析蜡高峰点的降低在一定程度上还有利于减少蜡组分的析出，具有一定清、防蜡作用。

2.6 菌株对蜡晶结构形态的影响

菌株处理前后含蜡原油样品中的蜡晶结构如图6 所示。从图6(a)可以看出：加菌处理前含蜡原油中的蜡晶尺寸大、成块状聚集、分布密集。含蜡原油经过嗜蜡菌处理后，油中蜡晶数量减少，结构尺寸减小且分布更为稀疏，从而使蜡晶间不易形成稳固的结构，一定程度上可减少蜡沉积的形成。

图6 菌株处理前后含蜡原油中的蜡晶结构Fig.6 Structure of wax crystal in crude oilbefore and after strain treatment(a) Before strain treatment; (b) After strain treatment

2.7 菌株对原油流变性的影响

不同温度及不同剪切率条件下测得菌株处理前后含蜡原油样品的黏-温曲线如图7所示。可以看出，含蜡原油经嗜蜡菌处理后，含蜡原油非牛顿流体黏度从488.4～5259 mPa·s下降到400.5～4294 mPa·s，黏度约下降18%，反常点由46 ℃降至44.5 ℃。黏度与反常点是判定原油流动性好与差的重要指标，二者数值越低越利于提高原油流动性能。该菌株通过降解石蜡，降低了含蜡原油的黏度及反常点，从而有效提高了含蜡原油流动性。

图7 菌株处理前后含蜡原油的黏-温曲线Fig.7 Viscosity-temperature curves of waxy crude oil before and after strain treatment(a) Before strain treatment; (b) After strain treatment

3 结 论

(1)嗜蜡菌经16SrDNA鉴定为假单孢菌属。该菌株最适生长环境为温度37 ℃、pH值7.0、NaCl质量分数为1%。

(2)该嗜蜡菌具有较强的表面活性，能产生脂肽类生物表面活性剂，可将发酵液界面张力由78.26 mN/m降低至37.45 N/m，乳化系数达到70%，并具有较强的排油活性及良好的疏水性能。

(3)含蜡原油经嗜蜡菌处理7 d后，油样中蜡晶结构尺寸减小及数量减少，可使含蜡原油析蜡点降低1.27 ℃、析蜡高峰点下降1.19 ℃、蜡含量降低43%、黏度降低18%，有效提高了含蜡原油流动性。