野生草莓种子高效萌发体系及离体再生体系的建立

赵映洁　徐炜　白本文　段可　朱开才

摘 要 以野生草莓YW种子及其无菌苗叶片为试验材料，分别建立野生草莓种子高效萌发体系及叶片离体再生体系。结果表明：通过隔夜浸泡，旋涡振荡仪清洗草莓种子，并用5%NaClO消毒5 min，春化7 d，草莓种子萌发率高达73%;叶片最适不定芽诱导植物生长调节剂配比为IBA 0.1 mg·L-1+6-BA 3.4 mg·L-1。

关键词 野生草莓种子;高效萌发;离体再生

中图分类号：S668.4 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.21.001

草莓（Fragaria×ananassa Duchesne）属蔷薇科、草莓属多年生草本植物，是十分美味的水果之一[1]。全世界草莓属约24个种，主要分布在亚洲、欧洲和美洲[2]。我国地域辽阔，气候类型多样，有着丰富的草莓资源，是世界上野生草莓种类最丰富的国家[3]。野生草莓具有广泛的适应性和多种优良特性，有些野生草莓在风味、品质、抗病虫害等方面表现突出，可以作为改良栽培草莓的重要材料[4]。但国内有关草莓离体再生的报道大多都为栽培草莓，野生草莓离体再生的研究在国内报道较少[5-9]。基于此，以野生草莓Yellow Wonder（YW）为试验材料建立高效的无菌种子萌发体系及叶片离体再生体系，为提高栽培草莓的品质和抗病虫害能力等良种培育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料

饱满有活力的YW种子。

1.1.2 培养基及培养条件

种子萌发培养基及不定芽诱导培养基均添加7 g·L-1的琼脂，pH为5.7～5.8，121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min备用。

除暗培养外，所有试验材料的培养条件均为16 h（光）/8 h（暗），光强2 000～3 000 lx，温度23～25 ℃。

1.1.3 试剂

1/2MS、MS、IBA、6-BA、琼脂、蔗糖等，均购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 YW种子消毒处理

YW种子浸泡过夜，隔天用旋涡振荡仪清洗，用剪过的1 mL枪头吸掉杂质及瘪种，直至上清液完全澄清;分别使用3% NaClO、4% NaClO、5% NaClO消毒5 min，期间用旋涡振荡仪低速振荡;立即吸掉消毒液，无菌水清洗6～8次，然后吸打在1/2MS平板上，晾干水分后封口;每个处理3个重复，4 ℃春化7 d，报纸遮光处理21 d后统计萌发率及污染率。

1.2.2 YW不定芽誘导

选取YW叶龄及生长状态一致的继代组培苗叶片，去掉叶缘，剪成0.3～0.5 cm2的小块，正面朝下置于6-BA浓度梯度为3.0 mg·L-1、3.4 mg·L-1、3.8 mg·L-1的培养基上进行处理，每个处理3个重复，30 d统计愈伤，60 d统计不定芽。

1.2.3 数据分析

用SPSS.17.0进行统计分析，WPS11.1进行作图。

种子萌发率（%）=发芽种子粒数/萌发种子总粒数×100%

污染率（%）=污染外植体数/接种外植体总数×100%

0级愈伤发生率（%）=0级愈伤发生外植体数/总接种外植体数×100%（1～4级愈伤发生率类推）

分化率（%）=出芽的外植体数/接种外植体总数×100%

根据愈伤发生面积将其分为0～4五个等级，如图1所示。

2 结果与分析

2.1 消毒液浓度确定

图2结果表明，随着NaClO浓度的升高，种子萌发率先升高后降低，最高可达90%。而污染率随着NaClO浓度的升高而降低，当NaClO浓度达到5%时，污染率降到了0%，种子萌发率可达73%。

2.2 6-BA对YW叶片再生的影响

如图3所示，用6-BA诱导愈伤组织的分化，当6-BA浓度达到3.4 mg·L-1时，YW的3级、4级愈伤相比3.0 mg·L-1

6-BA显著增加，分别为44.0%和20.0%，且在该浓度下愈伤生长状态良好。当6-BA浓度达到3.8 mg·L-1时，0级、1级愈伤均降至2.3%，4级愈伤增至34.1%。

图4表明，YW在6-BA浓度达到3.4 mg·L-1时，相比其他两个浓度不定芽分化率最高，达26.4%。

3 小结与讨论

草莓种子小、种皮厚、吸水透气性差且种子内存在抑制物，导致种子发芽率极低，严重限制了草莓新品种杂交选育进程[7]。基于此，通过消毒前浸泡种子，用旋涡振荡仪创伤种皮的方法提高了消毒处理后草莓种子的萌发率，并得出了最佳的消毒条件：5%NaClO处理5 min。在该条件下消毒种子后春化7 d，种子萌发率可达73%，高于李文砚等[8]试验中的70%。

有研究发现，在草莓叶片离体再生试验中，细胞分裂素浓度高时会抑制不定芽的形成，促进愈伤组织的生长[9]。通过以上研究，发现随着6-BA浓度的不断升高，YW的愈伤再生率逐渐增大，当达到一定浓度时，愈伤诱导率可达100%，但不定芽诱导率却随着细胞分裂素浓度的增大呈现出先增大后降低的趋势，这与前人研究结果一致。因此，叶片最适不定芽诱导植物生长调节剂的配比为：IBA 0.1 mg·L-1+6-BA 3.4 mg·L-1，不定芽发生率为26.4%。

参考文献：

[1] Johnson AL， Govindarajulu R， Ashman TL. Bioclimatic evaluation of geographical range in Fragaria （Rosaceae）： consequences of variation in breeding system， ploidy and species age[J]. Botanical Journal of the Linnean Society，2014，176（1）：99-114.

[2] 雷家军，薛莉，代汉萍，等.世界草莓属（Fragaria）植物的种类与分布[A].中国园艺学会：草莓研究进展（IV）[C].2015.

[3] 雷家军，代汉萍，谭昌华，等.中国草莓属（Fragaria）植物的分类研究[J].园艺学报，2006（1）：1-5.

[4] 马鸿翔，陈佩度.草莓属低倍性野生资源在育种中利用的研究进展[J].果树学报，2003，20（4）：305-309.

[5] 周宇，张志宏，刘月学，等.野生二倍体草莓叶片离体再生及四倍体诱导[J].江苏农业科学，2010（3）：44-46.

[6] 孙立茹，刘月学，孟楠，等.野生草莓EMC离体快繁和叶片再生的研究[J].山东农业科学，2009（4）：9-12.

[7] 梁中午，庞晓倩，冯彩莲，等.3种浸种方法对草莓种子发芽率的影响[A].中国植物保护学会2018年学术年会论文集：绿色植保与乡村振兴[C].2018.

[8] 李文砚，孔方南，韦优，等.草莓种子萌发成苗及高效离体再生体系的建立[J].西南农业学报，2016（10）：2463-2469.

[9] Landi L， Mezzetti B. TDZ， auxin and genotype effects on leaf organogenesis in Fragaria[J].Plant Cell Reports，2006，25（4）：281-288.

（责任编辑：赵中正）