急性缺血条件下的动物脑部电阻抗特性变化规律的实验研究

周怡敏，陈真辉，史学涛，亢君君，付峰

空军军医大学 a. 军事生物医学工程学系；b. 基础医学院，陕西 西安 710032

引言

最新数据表明，全世界每隔6 s 就有一人死于脑卒中[1]。近年来，脑卒中已成为我国单一器官致死原因的第一位[2]。由于中枢神经组织细胞的脆弱性和不可再生性，脑卒中发生后会在很短的时间内造成不可逆的脑功能损伤，因此早发现、早治疗是提高脑卒中救治效果、降低残死率的关键[3]。同时，脑卒中分为脑出血和脑梗这两种完全不同类型，这两类脑卒中不仅治疗措施完全相反（脑梗需要尽早溶栓治疗，而脑出血则着重需要止血），脑梗患者更是具有因缺血血管壁变性而引发进一步脑出血的风险[4]，因而脑卒中的超早期正确诊断及对其病程的实时动态监测对于临床救治意义重大。

以CT、MRI 为代表的现代医学影像技术主要以组织的器质性变化为基础，虽然对脑出血具有较高的敏感性，但对超早期、尚未形成明显坏死的脑缺血性病变则不够敏感，往往需要等到细胞发生明显变性，达到不可逆坏死阶段才能体现，无法在有效治疗时间窗内提供准确信息，更无法满足病程发展的实时监测要求[5-6]。电阻抗成像（Electrical Impedance Tomography，EIT）技术是一种实时、无创、安全的功能性成像技术，以目标电阻率变化或电阻抗分布进行成像，由于脑组织受到损伤后，血脑屏障被破坏或者细胞膜的离子通道功能异常都会引起导电性溶液在血液、细胞间质、细胞内的分布平衡被打破，这些不仅会导致脑组织的功能性病变，细胞膜内外的电阻抗特性也均会产生相应变化。同时在病变发展的不同阶段，病变组织及细胞的变化程度都有差异，电阻抗特性也会有相应的变化[7-11]。

国内外研究团队针对脑损伤组织的电阻抗特性开展了大量的研究工作，Horesh 等[12]的研究结果表明在1 kHz 以下，脑卒中组织的电阻抗显著高于正常组织；Lingwood 等[13]的报道也显示缺血缺氧后脑部电阻抗会明显上升；Harting等[14]也研究了大鼠脑损伤后的脑部电阻抗在500～5000 Hz频率段内的变化特性。Dowrick 等[15]也发现在0～250 Hz 频率范围内，正常和受损脑组织的电阻抗随频率的升高都有所降低，但是降低幅度有显著性差异。虽然近期的研究均表明脑损伤后脑组织的电阻抗特性会发生显著性变化，但由于各自的研究目标方面的差异，这些研究在脑损伤模型选择、电阻抗特性测量方法、所选择的测量频率范围、采取的电阻抗特性分析方法方面都有着显著的差异，得到的结果也不够统一。目前，相关领域对缺血后的脑卒中组织的电阻抗变化规律仍缺乏清楚认识，也未见有关不同进程与发展状态下的脑卒中组织电阻抗特性变化规律研究，导致生物电阻抗技术应用于临床早期诊断监测缺血性脑卒中还有一定的差距。因此，本文希望通过对缺血病变脑组织与正常脑组织的电阻抗频谱特性的对比研究，以及在病程发展的不同时间节点对脑卒中组织电阻抗的测量，认识缺血后的脑组织电阻抗特性变化规律，并寻求EIT 诊断监测早期脑卒中的最佳的频率点，以提高EIT 的成像精度，从而实现缺血性脑卒中发展状态的诊断与监测。

1 材料与方法

1.1 临床资料

本实验以雄性SD 大鼠（30 只）为实验对象，均来自空军军医大学动物实验中心，体重（250±10）g（8 周龄），饲养温度25℃±2℃，饲养时不控制大鼠的饮食。本研究中的所有动物实验方案均经空军军医大学动物伦理委员会的批准和支持。

1.2 仪器与方法

1.2.1 脑缺血动物准备及模型制备

所有动物术前禁食12 h，不禁水，使用10%的水合氯醛（3.5 mg/kg）对大鼠进行腹腔注射麻醉。于大鼠右侧大脑颅骨钻两个直径1 mm 的孔，深度以不破坏硬脑膜为准，插入牙科钉固定作为电极（图1），以前囟为坐标原点，其右侧与上方为正方向，则两个电极的位置坐标分别为（3 mm，2 mm）、（3 mm，-8 mm），电极间距为1 cm。采用两电极法在体测量大鼠脑组织缺血前后的电阻抗频谱特性。

图1 测量电极位置分布

脑缺血模型采用线栓法梗阻大脑中动脉（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO），造模过程如图2a所示。大鼠仰卧位固定，在颈正中线偏右1 mm 处切口（1.5～2 cm），沿胸锁乳突肌方向，小心剥离血管壁附近的迷走神经，依次分离右侧颈总动脉（Common Carotid Artery，CCA）、颈外动脉（External Carotid Artery，ECA）和 颈 内 动 脉（Internal Carotid Artery，ICA）。 在CCA、ECA、ICA 的近心端各绕细线备用。待电阻抗数据测量开始后，结扎实验组动物的CCA 和ECA 的近心端，然后在距离CCA 分叉口1～2 mm 处切口，将线拴插入ICA 中，深度控制为18 mm，梗阻右脑中动脉，扎紧预留的细线，最后缝合伤口。

图2 MCAO模型制备及电阻抗频谱特性测量

1.2.2 脑组织电阻抗频谱特性测量

应用以Solartron1260 电阻抗分析仪和1294 生物电阻抗测量接口为核心的电阻抗频谱测量平台进行大鼠脑组织的电阻抗频谱特性测量。测量频率范围为10 Hz～1 MHz，采用对数扫频模式，每十倍频十个点，共测61 个频率点。

从实验大鼠中随机选取24 只为模型组，首先采集造模前的脑部电阻抗频谱信息，随后进行MCAO 造模，分别于造模完成后0.5、1、1.5、2、2.5、...6 h 测量并观察动物脑部电阻抗变化特性。实验过程中，采用10% 的水合氯醛以0.2 mL/ kg·h 的速率进行腹腔注射，以维持大鼠的麻醉状态，同时用恒温箱维持大鼠的体温在37℃左右（图2b）。

1.2.3 微观形态学对照

采用相同方法对剩余6 只大鼠进行MCAO 造模，连续测量右脑电阻抗频谱3 h，随后将大鼠深度麻醉，使用2%多聚甲醛和2%戊二醛进行心脏灌注后取脑，采用透射电子显微镜分别观察实验动物左右侧脑组织血脑屏障的完整性。

1.2.4 数据分析

使用SPSS 14.0 软件对脑组织的电阻抗频谱特性数据进行统计学分析，对缺血前后不同时间点的数据进行配对样本t 检验分析。

2 结果

2.1 电阻抗变化规律

建立MCAO 模型后6 h 内，脑组织电阻抗数值与缺血前数据相比：缺血0.5 h 后阻抗值有所下降；但0.5～3 h 之间，电阻抗数值呈近似线性、快速上升；3～6 h 阻抗数值虽有增加但趋势不明显（图3）。；由缺血前为对照不同频率下的脑电阻抗相对变化率随时间的变化曲线可见，脑阻抗在1、10 以及100 kHz 的频率下的相对变化率较高（图4）。

图3 缺血6 h内不同频率下的动物脑电阻抗随时间变化曲线

图4 相对缺血前的电阻抗变化率随时间变化曲线

缺血前及缺血1、2 和3 h 脑电阻抗随频率的变化情况如图5 所示。由图5 可知，随着频率的上升，脑电阻抗整体呈下降趋势，在1 MHz 的频率下达到最低值。同时，从变化速率上看，在10～100 Hz 频率范围内，缺血后的阻抗随频率变化速率小于缺血前。

图5 缺血前与缺血后3 h的电阻抗频谱

2.2 微观形态学结果

缺血3 h 后脑组织血脑屏障微观结构如图6 所示。由图6a 可以看出，缺血3 h 后左脑灰质的微血管内皮细胞、星形胶质细胞终足和基底膜结构完整，间隙连接存在（黄色圆圈），表现为内皮细胞间深染的致密条带；图6b 是缺血3 h 后右脑灰质微血管超微结构的发展变化，可见血管内皮细胞较完整，间隙连接存在，但星形胶质细胞终足水肿明显（箭头），与微血管基底膜接触的完整性破坏，基底膜增厚。

图6 缺血3 h后脑组织血脑屏障微观结构

3 分析与讨论

脑卒中超早期检测对于提升缺血性脑梗患者的临床救治效果至关重要。生物EIT 技术依据脑组织电阻抗特性与组织功能状态密切相关，有望实现此类疾病的超早期检测。既往的研究中，已有部分学者对缺血后的脑组织电阻抗变化特性进行了观察，如：Dowrick 等[15]研究发现在1 Hz～3 kHz 的频率范围内缺血比正常脑组织的阻抗值大；Wu 等[16]也报导了缺血与正常脑组织在低频时的电阻抗差异最大。

由上述研究现状可以看出，目前国际上对缺血后脑组织电阻抗变化规律并未明确，为提高EIT 技术对脑缺血早期检测的敏感性，有必要开展进一步研究，以确定缺血后的脑组织电阻抗特性随时间及频率的变化特性，为进一步的成像检测研究奠定基础。为此，本研究系统的测量了脑缺血损伤后6 h 之内的阻抗频谱变化，在多个时间点分析了缺血性损伤后的脑组织阻抗随频率的变化规律，并对缺血3 h 的阻抗变化与超微观脑组织的结构进行了定性分析。

3.1 缺血后脑组织电阻抗随时间的变化

与以往的研究工作不同，本研究在10 Hz～1 MHz 范围内全面测量了缺血性脑损伤发生后6 h 内不同时间点的脑阻抗。从图3 所示的各频率下脑阻抗随时间的变化结果可以看出，缺血后前半小时的脑部阻抗呈轻度下降，但在随后的2.5 h 内呈快速、近似线性的上升变化，3～6 h 呈近似平台样变化。可明显观察到缺血3 h 是脑阻抗变化的拐点。此时，脑组织阻抗达到阶段性的最高点，此后的阻抗变化相对平稳，提示这一时刻可能是缺血脑组织发生微观层面变化的关键时期。同时依据脑阻抗随时间的变化特性有望为脑缺血性损伤的程度评价提供支撑，从而为EIT 成像技术在超早期缺血性脑卒中的诊断和监测应用奠定基础。

3.2 缺血后脑组织电阻抗随频率的变化

由图5 可见，随着频率的升高，MCAO 造模前后脑组织的电阻抗数值都逐渐减小，且在频率10～100 Hz 范围内，随着频率的升高，缺血脑组织电阻抗随频率的下降速率小于正常脑组织。这与Dowrick 等[15]在体测量大鼠缺血脑组织的结论一致。

由于造模成功后缺血性损伤的脑组织阻抗值在3 h 达到阶段性的最高点，为进一步分析此期间的脑阻抗变化规律，我们依据公式计算得出1、2、3 h 相对缺血前的阻抗相对变化率，结果如图7 所示。可见缺血后1、2、3 h 的阻抗相对变化率随频率呈非线性变化，整个频域区间内3 h、2 h 的数值明显高于1 h。其中1 kHz 以下，变化率均随频率增加而快速上升，100 kHz 以上，缺血2 h 和3 h的相对变化率随频率上升而下降；坐标（3 h，79.4 kHz）、（2 h，100 kHz）处阻抗相对变化率分别为48.7%和22.2 %，达到最大。

图7 缺血不同时间的阻抗相对变化率随频率的变化曲线

缺血1 h 的脑部电阻抗变化相对较弱，因此仅选取缺血后3 h 和2 h 的结果与缺血前对比。3 h 的数据选取频域区间内代表性的频率点100 Hz、1 kHz、10 kHz、79.4 kHz、1 MHz，同理在2 h 时间点选取100 Hz、1 kHz、10 kHz、100 kHz、1 MHz 进行对比。图8 的分析结果表明，在各个频率点上缺血3 h 脑组织的电阻抗数值与缺血前正常组织的差异都有显著性。综上，缺血3 h，频率为79.4 kHz 时，脑组织的阻抗相对变化率达到最大（48.7%），且与缺血前阻抗值的差异有显著性。

图8 缺血前与缺血后2 h（a）、3 h（b）的脑阻抗数据对比

我们一般认为缺血条件下的低频阻抗变化更为显著，但由于颅骨的屏蔽作用，低频电流很难穿过颅骨。而本研究依据在体测量要求，通过颅骨外注入电流，观察到最大阻抗变化率发生在70 kHz 左右，此频率附近，颅骨电阻率相对低频时已经有了较大幅度下降[17]，因而激励电流能够较好穿透颅骨，实现颅内缺血组织状态的区分。综上，3 h很可能成为EIT 技术诊断监测脑缺血损伤的非常关键的时间点，同时在上述时间及频率附近，EIT 技术对缺血性脑卒中具有较高的敏感性。

3.3 缺血后脑组织超微结构改变及其与电阻抗特性变化相关性分析

理论上，缺血后脑组织电阻抗特性主要取决于两个因素：血脑屏障变化和脑细胞体积变化。血脑屏障一般由微血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞和基底膜构成，其中星形胶质细胞终足通过包绕约85%的脑微血管表面，形成脑微血管的多层膜性结构，有效防止循环中大分子物质和电解质进入脑实质，以维持神经系统内环境的稳定。血脑屏障被破坏后，电解质可自由通过血脑屏障，从而导致脑组织电阻抗的下降。而缺血后的脑细胞体积变化主要是脑细胞因缺氧导致的能量代谢障碍，使得细胞外离子内流、胞内渗透压上升，进而引起细胞水肿。脑细胞水肿后，细胞体积增大且间隙变窄，从而会导致脑组织电阻抗的上升。

从缺血后的脑电阻抗变化情况可以看出：缺血后前3 h的阻抗整体呈上升变化。这很有可能是脑细胞缺氧、水肿变化导致的。在本研究的透射电镜结果证实，脑缺血损伤3 h 时，右侧大脑皮层的微血管壁周围紧密包绕的星形胶质细胞终足发生明显水肿，呈现空白区域，神经元和胶质细胞发生肿胀，但内皮细胞的间隙连接未见明显破坏。电镜结果表明血脑屏障结构中有细胞水肿的出现，但血脑屏障尚保持完整，阻抗上升变化与预期结果相符。

缺血3 h 以后脑电阻抗变化趋势的改变很有可能与脑细胞的进一步水肿的同时，血脑屏障的完整性被破坏相关。Kwon 等[18]对脑缺血后微血管超微结构的研究证实，星形胶质细胞终足与微血管基底膜接触的完整性于缺血再灌注4 h 后明显下降，48 h 后完整性几乎完全被破坏。如前所述，血脑屏障的完整性破坏后，脑阻抗有下降趋势；与此同时，由于脑细胞的持续缺氧，细胞水肿程度进一步加剧，从而导致脑阻抗有上升的趋势。可能正是这两方面因素的共同作用，才使得缺血3 h 以后的脑阻抗呈现出阶段性相对平缓的变化趋势。

4 结论

本文研究了缺血性脑损伤后脑组织电阻抗随频率和时间的变化规律。结果表明，缺血性损伤后，不同时刻、不同频率下的脑组织电阻抗变化特性均不同。其中，前3 h呈现快速上升趋势，缺血3 h 时的脑电阻抗与缺血前存在显著差异，且在79.4 kHz 时具有最大的相对变化率。提示我们：通过测量频率的优选（3 h，79.4 kHz）有望进一步提高EIT 等阻抗测量技术对脑缺血性损伤检测的灵敏度，而脑组织电阻抗随时间变化特性也有望为脑缺血性损伤的程度评价提供支撑，从而为EIT 成像技术在超早期缺血性脑卒中的诊断和监测应用奠定基础。