提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达方法研究进展

张　真　汪　燕　马振刚

提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达方法研究进展

张真汪燕马振刚

（重庆市动物生物学重点实验室，重庆市媒介昆虫重点实验室，重庆师范大学重庆401331）

大肠杆菌表达系统与其他外源表达系统相比具有重组蛋白产量高、易操作、生长速度快和成本低等特点。通过大肠杆菌表达重组蛋白是一种既高效又经济的途径。然而，外源蛋白在大肠杆菌中表达时往往处于还原性环境的胞质中，而在胞质中外源蛋白不易形成二硫键，出现外源蛋白无法正确折叠的现象，从而形成不可溶的包涵体。文章在近年提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达研究的基础上，从选择适当的载体和宿主、外源蛋白与其他辅助蛋白共表达、降低蛋白合成速率、提高周质蛋白表达、融合标签表达、肽标签表达、替换蛋白质中的氨基酸、改变培养基的条件等方面进行了综述，为研究者根据外源蛋白自身特点，优化外源蛋白可溶性表达方法提供了参考。

外源蛋白；可溶性表达；大肠杆菌；包涵体

目前大部分蛋白质功能研究需要的是可以大量纯化并且可溶的蛋白质，但不管是天然提取还是使用化学合成纯的蛋白质都是非常困难的[1]，而DNA重组技术提供了一种经济的外源蛋白获取方式。大肠杆菌以易于遗传操作、繁殖速度快、表达重组蛋白产量高、培养成本低等特点优于其他蛋白质异源表达宿主。然而大肠杆菌无法实现蛋白质转录后的修饰，同时大肠杆菌胞质内还原性环境不利于二硫键的形成和稳定，造成部分重组蛋白无法正确折叠，进而形成不溶于水的包涵体。文章就如何提高大肠杆菌外源蛋白可溶性这一问题进行了系统的阐述。

1 选择适当的载体和宿主

选用适当的载体和菌体相结合可明显提高外源蛋白的可溶性，例如，使用在载体上插入一些本身溶解性很高的多肽片段的载体间接地提高外源重组蛋白在大肠杆菌中表达时的可溶性。陈阿娜等[2]已经证实某抗体片段在使用大肠杆菌系统表达时，对pAVEwayTM质粒进行改造后，载体携带着目的基因在大肠杆菌系统中成功表达出外源蛋白，且其表达量和可利用性显著提升。邢伶越等[3]运用翻译偶联和辅助蛋白构建了一种最新原核表达载体并成功使RA蛋白在大肠杆菌中完成高水平非融合性可溶表达。

另外，选择合适的菌株明显可以增强外源蛋白的可溶性及其活性。如果外源可溶性蛋白在大肠杆菌中表达定位在胞质或周质空间，极易被大肠杆菌本身定位表达在此处的蛋白酶所降解而失活，因此使用蛋白酶缺失的菌株就可避免该情况的发生。IgnatovaZ等[4]人选用 BL 21（DE3） 作为重组青霉素酰胺酶的宿主，结果表明表达产物比使用其他宿主菌的效果好且可溶性更高。由于大肠杆菌的细胞质环境不是适合二硫键形成的有利环境，且存在类似真核细胞中翻译后修饰功能的菌株又极为少见，故而极易导致外源蛋白不能正确表达。FatemehKhodabakhsh等[5]挑选了TOP10 型大肠杆菌菌株促使外源蛋白形成了正确的二硫键，提高了可溶性蛋白的表达且所表达的蛋白具有活性。

2 外源蛋白与其他辅助蛋白共表达

分子伴侣是指细胞中一类可与正在合成或部分折叠的多肽结合的蛋白质，主要通过阻止或校正错误的疏水结构来实现肽链的正确折叠，但不构成最终产物的一部分。有关大肠杆菌的分子伴侣可分为三类，分别是触发因子TF、HSP70 和伴侣蛋白。TF之所以被列为三类分子伴侣中的首要分子伴侣，是因为它具有肽基脯氨酰基顺反异构酶活性的细胞质酶[6]。折叠酶是指帮助蛋白质正确折叠的酶，例如DsbA和二硫键异构酶（PDI），其还具有部分分子伴侣的活性。另外，在选用强启动子的情况下，大肠杆菌中外源蛋白的表达量通常比较可观，而大肠杆菌自身的辅助折叠因子（如折叠酶和分子伴侣）却无法保证外源蛋白正确表达的条件，故共表达分子伴侣与其他辅助蛋白（如折叠酶）的方式可为源蛋白的成功表达和正确折叠提供充足的保障，从而提高外源蛋白的可溶性及其表达产量。王艳芳等[7]已证明2种分子伴侣pG-Tf2和pG-KJE8能显著提高牛支原体一个膜蛋白M1的截短片段的可溶性表达，且不改变其活性。还有研究发现，多种分子伴侣联合使用，可能会比单独使用的效果更佳。目前分子伴侣的合并使用的研究已经被报道，如 DnaKDnaJ-GrpE系统和 GroEL-GroES系统。Chen等[8]已经证实DnaK-DnaJ-GrpE系统对于在周质中高产率地在表达外源蛋白具有明显作用。Sahu等[9]运用 GroEL-GroES系统也进一步证实了这一观点。

3 降低蛋白合成速率

大肠杆菌的最适培养温度在38 ℃左右，但通常在该条件下很难得到需要的外源重组蛋白，原因是在这个温度条件下，外源蛋白处于高水平表达状态，其正确折叠速率不及新生肽链的聚集速率，造成肽链的堆积和包涵体的形成。研究表明，肽链的形成、折叠和聚集的速率同时决定最终活性蛋白的表达率。因此，降低蛋白合成的速率对提高活性蛋白的产率尤为重要。常用的方法有以下几种：（1）通过降低培养温度，一方面在降低蛋白合成的速率的同时，还可降低可溶性蛋白的降解速率，另一方面还能防止菌体进行厌氧生长和最终乙酸的生成，质粒的稳定性也有相应的增加，抗生素的半衰期更长，但温度过低菌体就会停止生长，蛋白也不表达，所以，一般16 ℃为最佳培养温度。（2）选择合适的启动子，一般采用强度较弱的 lac等启动子使翻译效率与之相关表达速率相互匹配，因为高强度的启动子会使表达的蛋白多为包涵体。适当的启动子能够使目的基因高效表达、减少本底表达并且其诱导方法简单又实际[10 ]。（3）使用较低浓度的诱导剂。当菌体生长处于指数生长期时，繁殖速度快，更有利于可溶性蛋白的表达，而诱导剂则为终浓度为0.1mMIPTG。

4 提高周质蛋白表达

在大肠杆菌中外源蛋白通常表达定位在三处——细胞的胞质、周质空间以及细胞外（极少数）。其中，胞质中蛋白表达效率最高，但在大肠杆菌胞质表达的蛋白质由于肽链的二硫键无法正确形成，会促使形成包涵体，此时还需经过其他的步骤才能获得所需要的功能性蛋白[11 ]。在大肠杆菌中唯一能形成二硫键的位置在周质空间，因此要想获取可溶性蛋白，可利用插入的信号肽将外源蛋白定位在周质中。P．Oelschlaeger等[12 ]在大肠杆菌中表达scFv，s单链抗体片段时，在scFv，s的N端连接上信号肽PelB，该信号肽的插入成功引导外源蛋白表达定位在周质空间中。霍世元等[13 ]将抗 VEGF单克隆抗体 Fab片段的CDNA与OmpA信号肽连接并克隆到表达质粒中，构建出重组质粒，其后在细胞周质中成功检测到产物，将其纯化后仍有相关活性。

5 融合标签表达

由于使用融合标签表达可提高宿主中外源表达时的可溶性，所以当改变环境条件（如温度）却不能解决外源蛋白可溶性问题时可以选择使用融合标签表达的方法来缓解该情况。融合蛋白是指将靶蛋白连接在一些易于表达或纯化的“融合标签”（fusiontag）的N－末端或C－末端，进一步实现外源蛋白的可溶性表达[14-15]，常见的融合标签见1。除此之外，最近还发现一种新型的FH8[16]标签。Costa等[17]将GST、NusA、His、MBP、Trx几种常用的标签与8 kDa的FH8新融合标签进行了比较，研究结果表明FH8标签的促融作用比MBP、NusA或Trx融合标签更为显著，而且经过该标签表达出的目的蛋白仍保持原有生物活性，因此FH8标签与其它大分子融合标签相比可以作为一种新的融合标签。HanY等[18 ]已证实麦芽三糖结合蛋白可作为新的融合标签增加靶蛋白在大肠杆菌中的溶解度，即HE-MBP（Pyr）融合标签增加异源蛋白质在大肠杆菌中的相对表达和溶解度。

表1　常见的融合标签

6 肽标签

小肽标签已被用作外源蛋白的溶解度增强标签，几乎更早于蛋白质融合标签。这些肽标签相对较短，主要由一到两个氨基酸且重复不同的次数组成，通常总长不超过15 个残基[19 ]。小肽标签可在不干扰相关蛋白结构和不损害蛋白质活性的情况下发挥作用，且在后期不需要额外的步骤对其进行去除。Hage, N.等[20 ]已证实在蛋白的C-末端添加一种六赖氨酸作为标记，可明显提高由其假定的胞外结合结构域组成的重组BabA的产量。且ParaskevopoulouV所在的实验小组将一种周质表达方法和肽标记两种方法相结合，已成功表达出一种异源粘附素。

7 替换氨基酸

包涵体形成的一个关键因素是氨基酸序列，因此替换其中的一个或几个氨基酸来增加可溶性蛋白的表达也为一种可行的方法。其原理可能是由于蛋白质的氨基酸被替换后，其稳定性增加或是疏水性发生了改变。KimBG等[21 ]利用氨基酸替换的方法成功使α-1，3岩藻糖基转移酶突变体的可溶性蛋白表达水平和活性显著提高，并成功申请专利。这表明替换氨基酸的方法可行，但诸多细节问题还仍需进一步进行验证。

8 改变培养基的条件

培养大肠杆菌的环境也是影响外源蛋白的可溶性表达的关键因素之一。首先，可根据所选择的菌株和需要表达的目的外源蛋白的特征来选择适当的pH，并保持培养基中pH的相对稳定（通气的环境更有利于高产量活性蛋白的表达）。培养基的pH与外源蛋白的等电点相差越大，所表达的蛋白就更容易形成可溶性蛋白。其次，加入一些微量元素（如Zn、Mg、Cu等）、碳源（如蔗糖、甘油等）、磷酸钾缓冲液、乙醇等化学物质，对提高外源蛋白的可溶性有极显著的作用。杨彩云等[22]在利用重组工程菌表达AiiA蛋白时，在以牛肉膏蛋白胨培养基为基础的条件下，在培养基中加入了蔗糖等不同种碳源、磷酸钾缓冲液（保证pH值的稳定）和一些微量元素等，结果表明这些化学物质在不同程度上提高了所表达的外源蛋白的可溶性。

9 展望

目前大肠杆菌作为外源蛋白表达的首选宿主菌，虽然已有许多提高外源蛋白可溶性表达的方法，但是因为蛋白质种类繁多和蛋白质性质各异，使得这些方法仍存在一些局限，所以必须经过大量的试验才能找到合适的宿主菌与载体，实现具体蛋白质具体分析。在蛋白表达时最主要的缺陷是在高效表达时易形成包涵体，所以想要获得可溶性外源蛋白还需要不断地进行新的尝试与摸索。

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Advances in Improving the Soluble Expression of Escherichia Coli Recombinant Protein

Zhang ZhenWang YanMa Zhengang

（Chongqing Key Laboratory of Animal Biology, Chongqing Key Laboratory of Vector Insects, Chongqing Normal University, Chongqing 401331）

Compared with other exogenous expression systems, escherichia coli expression system has the characteristics of high yield, easy operation, fast growth rate and low cost of recombinant protein. It is an efficient and economical way to express recombinant protein through escherichia coli. However, when expressed in escherichia coli, exogenous proteins tend to be in the cytoplasm of the reductive environment, whereas in cytoplasm, exogenous proteins are not easy to form disulfide bonds, and foreign proteins cannot fold properly, thus forming insoluble inclusion bodies. On the basis of improving the soluble expression of escherichia coli recombinant protein, the article summarized from selecting the appropriate carrier and the host, exogenous proteins are co-expressed with other helper proteins, reducing the rate of protein synthesis, improving the periplasmic protein expression, expression of fusion tag expression, peptide tag expression, replacing amino acids in a protein, changing the condition of culture medium and other aspects, providing a reference for researchers to optimize the soluble expression of exogenous proteins according to their own characteristics.

exogenous proteins; soluble expression; escherichia coli; inclusion body

Q78

A

2095-1205(2019)07-37-04

10.3969/j.issn.2095-1205.2019.07.23

国家自然科学基金面上项目《东方蜜蜂微孢子虫孢壁蛋白及其与侵染功能相关性研究》（No：31770160），重庆市教委科学技术项目《东方蜜蜂微孢子虫孢壁蛋白Ncswp8的亚细胞定位及与侵染相关功能研究》（No：KJQN201800524），重庆市科委科学研究项目《基于RNAi技术的蜜蜂Aub基因抑制肠道微孢子机理研究》（No：cstc2018jcyjAX0832）。

张真（1996- ），女，汉族，硕士，研究方向为昆虫病原微生物学。

马振刚(1985- )，男，汉族，博士，副教授，研究方向：资源昆虫及其病原微生物学。