新型vip3Aa 基因的克隆表达及活性分析

关 鹏，代小娟，秦培刚，宋金东，贺志有

（1.渭南职业技术学院农学院，陕西渭南714026；2.新疆医科大学基础医学部，新疆乌鲁木齐830011）

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是全球应用非常广泛的一种微生物杀虫剂，其在生长过程中能产生多种对不同害虫具有特异性杀虫活性的毒素，如分泌期杀虫蛋白（Secreted insecticidal proteins，SIPs）、杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs，又称伴胞晶体蛋白）及营养期杀虫蛋白（Vegetative insecticidal proteins，VIPs）等[1-4]。Vip蛋白是Bt 菌株在营养期产生的，其序列是与杀虫晶体蛋白（Cry 和Cyt）完全不同的一类毒蛋白，对鳞翅目、半翅目、鞘翅目等多种害虫具有特异性杀虫活性[5-9]，因此，vip 基因资源的挖掘一直是国内外Bt研究的热点之一。

目前，已发现的Vip 蛋白共有147 个（截至2019 年4 月10 日），根据国际Bt 营养期杀虫蛋白的命名原则，将这些蛋白分为Vip1、Vip2、Vip3 和Vip4 四大类。其中，Vip1 和Vip2 可形成二元毒蛋白，对鞘翅目和半翅目害虫具有特异性杀虫活性[7-8]；Vip3 蛋白数量最多，分为Vip3A、Vip3B 和Vip3C等3 个亚类，共111 个，其对鳞翅目害虫具有特异性杀虫活性；Vip4 蛋白仅有一个，其杀虫活性尚不明确。在Vip3A 亚类中Vip3Aa 类蛋白数量最多，共66 个，这些蛋白之间同源性均在95%以上，但是序列中个别氨基酸的差异对不同Vip3Aa 类蛋白在杀虫谱和杀虫毒力方面都具有显著影响[10-12]。因此，对每个新型vip3Aa 类基因编码蛋白的杀虫活性研究具有非常重要的意义。

Bt TB22- 5 是从太白山森林土壤中分离得到的，能产生菱形伴胞晶体，是对鳞翅目的棉铃虫、甜菜夜蛾具有明显杀虫活性的菌株。本研究采用多对vip 基因通用引物对该菌株中vip 型基因进行鉴定，获得一个新型vip3Aa 类基因片段，通过对其全长序列的克隆及原核表达，并进一步研究表达蛋白的杀虫活性，旨在明确该新型vip3Aa 基因的杀虫活性，为其应用在农业害虫的生物防治中提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 野生型Bt TB22- 5 菌株、大肠杆菌DH5α 感受态细胞均保存于渭南职业技术学院农学院微生物实验室。

1.1.2 测试昆虫 棉铃虫和甜菜夜蛾标准化测试幼虫均饲养于渭南职业技术学院农学院微生物实验室。

1.1.3 培养基 蛋白胨和NaCl 各10 g，酵母提取物5 g，用无菌水定容至1 L，即做成LB 液体培养基；在LB 液体培养基中加入1.5% 琼脂粉即可做成LB固体培养基。

1.1.4 试剂 T4 DNA 连接酶、DNA 和蛋白质Marker、氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素、X- gal、IPTG、PCR SuperMix 均购自北京全式金生物技术有限公司；Axygen 质粒提取试剂盒及DNA 凝胶回收试剂盒均购于上海百赛生物技术有限公司；pMD19- T载体购自日本TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 Bt TB22- 5 质粒的提取及vip3A 基因的鉴定参照REYES- RAMÍREZ 等[13]的方法对Bt TB22- 5菌株中质粒DNA 进行提取。使用表1 中vip 通用引物对Bt TB22- 5 菌株的vip 基因进行PCR 鉴定。vip1- F 和vip1- R、vip2- F 和vip2- R 引 物 序 列 及PCR 反应条件参照HERNÁNDEZ- RODRÍQUEZ等[14]的 方 法；vip3- 1F 和vip3- 1R、vip3- 2F 和vip3- 2R引物序列及PCR 反应条件参照FANG 等[15]的方法。若鉴定vip3 型基因的2 对引物均能扩增出与其预测大小一致的产物，表明该扩增片段与vip3Aa1 基因具有高度相似性；如果仅有1 对引物扩增出与其预测大小一致的产物，则表明扩增片段是一个序列同源性较低的新型vip3 基因[12，15]。扩增产物经电泳检测及凝胶回收后，送深圳华大基因科技有限公司进行测序。

表1 vip 基因鉴定的通用引物

1.2.2 vip3Aa 基因的全长克隆及测序 鉴定获得的vip 基因片段经NCBI BlastX 在线分析工具比对分析后，设计并合成引物vip3Aa- F（5′- ATGAACAA GAATAATACTAAATT - 3′）和vip3Aa- R（5′- TTAC TTAATAGAGACATCGTAA - 3′） 用于vip 基因的全长扩增。扩增产物与克隆载体pMD19- T 连接形成重组子，经大肠杆菌DH5α 转化后，对阳性单克隆中的插入基因序列进行测序分析。

1.2.3 vip3Aa 基因的生物信息学分析 在NCBI数据库中使用BLASTx 工具对vip3Aa 基因序列的同源性进行分析；运用Vector NTI Advance 11 和DNAStar 生物信息学分析软件对vip3Aa 基因与其同源序列进行序列比对；以pET- 28a 为大肠杆菌表达载体，vip3Aa 基因表达载体构建的酶切位点设计，以及编码蛋白的序列同源性分析均采用DNAMAN 7.0.2.176 软件进行。

1.2.4 vip3Aa66 基因的表达及检测 以Bt TB22- 5质粒DNA 为模板，采用引物vip3Aa66- F：5′- CGCATGAACAAGAATAATACTAAATT- 3′（ 下划线部分为酶切位点：BamH I） 和vip3Aa66- R：5′-GCTTACTTAATAGAGACATCGTAA- 3′（下划线部分为酶切位点：Sal I） 对vip3Aa66 基因进行PCR 扩增。将扩增产物和pET- 28a 载体分别经过BamH I 和Sal I 双酶切后，经T4 连接酶连接后，得到重组质粒pET- vip3Aa66；重组质粒通过大肠杆菌DH5α 转化，筛选阳性单克隆，用BamH I 和Sal I内切酶对重组质粒进行验证；最后，重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中，并加入100 mL LB 液体培养基（含100 μg/mL 卡那霉素），在37 ℃180 r/min摇床中培养过夜。吸取5 mL 培养液加入到500 mL新鲜的无菌LB 液体培养基（含100 μg/mL 卡那霉素）中，在37 ℃180 r/min 下培养至菌液OD600值为1.6～1.8 时，加入500 μL 1 mol/mL IPTG 溶液后诱导表达8 h。培养产物经4 ℃5 000×g 离心10 min后，弃上清，沉淀于- 20 ℃保存备用。同时，空载pET- 28a 质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中经上述方法诱导表达后作为阴性对照。表达产物的SDSPAGE 蛋白电泳检测参照SCHÄGGER 等[16]的方法进行。

1.2.5 Vip3Aa66 蛋白杀虫活性测定 对Vip3Aa66表达蛋白粗提物称质量，然后加入10 mL 无菌水，振荡混匀后，悬液经梯度稀释法依次稀释成5，10，20，40，80，160，320 μg/mL 共7 组不同浓度的样品，等量的每组样品分别加入到适量养虫饲料中混匀，然后分别装入到12 孔培养板中。每孔中放入大小相同的二龄期幼虫2 头，每组样品3 次重复。同时以野生型Bt TB22- 5 菌株作为阳性对照，以加无菌水的饲料以及空载pET- 28a 质粒在大肠杆菌BL21（DE3） 中表达的粗提物作为阴性对照。28 ℃饲养7～10 d 后统计试验结果。

1.3 数据分析

杀虫活性测定数据经SPSS 10.0 软件分析，计算LC50值。

2 结果与分析

2.1 Bt TB22-5 菌株中vip 基因的鉴定

电泳检测结果表明，vip1- F 和vip1- R、vip2- F和vip2- R 引物扩增产物大小均约为150 bp，这与预测的扩增片段大小不相同；vip3- 1F 和vip3- 1R引物扩增产物约为450 bp，vip3- 2F 和vip3- 2R 引物扩增产物约为360 bp，这2 对引物扩增结果与预测的扩增片段大小一致（图1）。由此可推测，Bt TB22- 5 菌株中含有一个与vip3Aa1 基因同源性较高的vip3 型基因。通过对这2 个vip3 型基因鉴定片段的测序分析表明，其与vip3Aa1 基因的序列同源性分别为98.9%和99.5%。结果表明，Bt TB22- 5菌株中含有一个vip3Aa 型基因片段。

2.2 Bt TB22-5 菌株中vip3Aa 型基因的全长克隆及其序列分析

利用vip3Aa- F 和vip3Aa- R 引物对vip3Aa 型基因的全长序列进行扩增，扩增结果检测表明，PCR 产物大小约为2.4 kb（图2）。测序结果分析表明，该基因总长2 370 bp，其推导的编码蛋白由790 个氨基酸组成，分子量约为88.5 ku，等电点为5.02。Vip3Aa 类蛋白序列比对分析表明，该Vip3Aa 蛋白与已知的Vip3Aa9 蛋白质序列具有最高的序列同源性（99.1%），二者之间仅有4 个氨基酸不同（图3）。根据国际Bt 杀虫晶体蛋白基因的命名规则，该基因被正式命名为vip3Aa66 （GenBank 登录号为MK252100）。

2.3 vip3Aa66 基因的原核表达

表达产物的SDS- PAGE 分析表明，vip3Aa66基因表达约89 ku 大小的产物（图4），这与预测的vip3Aa66 基因编码蛋白质分子量大小相一致。

2.4 vip3Aa66 表达蛋白粗提物的生物活性分析

生物活性测定分析表明，vip3Aa66 基因表达蛋白粗提物对甜菜夜蛾幼虫具有较高的杀虫活性，其LC50值为23.75 μg/mL；对鳞翅目的棉铃虫幼虫杀虫活性较低，其LC50值为243.87 μg/mL。然而，与野生型Bt TB22- 5 菌株相比，vip3Aa66 基因表达产物的杀虫活性明显较低（表2）。

表2 vip3Aa66 表达蛋白粗提物对2 种鳞翅目幼虫的生物活性测定结果μg/mL

3 结论与讨论

Bt 是目前应用最为广泛的一种微生物杀虫剂，其内生质粒中携带的伴胞晶体蛋白编码基因（cry和cyt）被大量克隆并已应用在农林、卫生等害虫的生物防治中。然而，随着单一Bt 菌株或杀虫基因的长期使用，造成害虫耐药性不断出现，其防治效果日益降低[17]。因此，挖掘新的Bt 菌株资源、克隆新型杀虫功能基因成为解决害虫耐药性问题的有效手段。Vip 蛋白是Bt 菌株在营养期产生的一类对多种昆虫具有特异杀虫活性的、完全不同于Cry 蛋白的一类杀虫蛋白，而且Vip 和Cry 蛋白之间的交叉抗性极低[18]。因此，vip 基因作为一种新的杀虫基因资源，可成为cry 基因的替代品，有效延缓害虫耐药性的出现。

在已报道的Vip3Aa 类蛋白中，Vip3Aa11、Vip3Aa39、Vip3Aa46、Vip3Aa58、Vip3Aa59、Vip3Aa-60、Vip3Aa61 等蛋白对甜菜夜蛾幼虫均具有杀虫活性[6，11-12，19-20]。本研究表明，Vip3Aa66 蛋白与Vip3Aa类蛋白之间序列差异性极小，但是它们对甜菜夜蛾幼虫的杀虫活性却差异明显，甚至有些Vip3Aa 类蛋白具有更广泛的杀虫谱，如Vip3Aa39 蛋白对小地老虎（Agrotis ipsilon）幼虫也具有明显的杀虫活性[11]；亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis） 幼虫对Vip3Aa46蛋白敏感[19]；Vip3Aa58 和Vip3Aa59 蛋白均对苹果蠹蛾（cydia pomonella）有一定的杀虫活性[12]。因此，vip3Aa66 作为一个新型vip3Aa 基因，对其表达蛋白进行生物活性研究显得尤为重要。

之前杀虫活性分析表明，野生型Bt TB22- 5 菌株对棉铃虫和甜菜夜蛾幼虫的杀虫活性明显高于Vip3Aa66 蛋白，其原因可能是由于产伴胞晶体的Bt TB22- 5 菌株表达某些Cry 或Cyt 蛋白，或者产生某些其他的毒蛋白，这些毒蛋白之间有可能产生协同增效的作用。因此，在后续的研究中，将对Bt TB22- 5 菌株中其他杀虫基因进行研究，为该菌株在农业害虫的生物防治提供理论依据。