发酵苹果汁对腹泻小鼠稀便率和小肠组织结构的影响

王 婧，李 瑞，王吉祥，宫泽恩，孙子龙，王晓闻

（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801；2.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

腹泻是临床上经常出现的一种病症，而且在各种动物养殖业中也会频繁发生，若不及时对其采取措施进行诊治，将会造成动物的大批死亡，从而对各大养殖场造成无法估量的经济损失[1]。当机体处于健康状态时，肠黏膜能够阻挡细菌和病毒等穿过；但是当肠道黏膜的防御作用下降时，这些有害的物质就会透过黏膜诱发各种疾病。因此，腹泻与肠黏膜防御之间有着十分密切的关系。抗生素相关性腹泻是由于滥用或过量使用抗生素，从而导致机体的抗生素耐药性增加[2]，是临床上使用抗菌类药物过程中所发生的最为多见的副作用，尤其是氨基青霉素类、头孢菌素类等相对广谱的抗生素[3-4]。

益生菌的使用是调节肠道菌群的一种治疗措施，可以帮助恢复肠道微生物群并重建肠道内稳态[5-6]。URDACI 等[7]研究表明，用枯草芽孢杆菌或植物乳杆菌处理可以减少由脂多糖（Lipopolysaccharides，PS）诱导的腹泻。益生菌是有利于宿主健康的活的微生物，其存在于健康人类的肠道中，能够促进营养物质的消化吸收，提高机体免疫力，维持肠道菌群结构平衡，已被用于调节胃肠道微生物群和治疗各种肠道疾病，并且具有极好的安全效益比。OZDAL 等[8]研究表明，苹果是世界上最受欢迎的水果之一，其含有丰富的多酚和纤维，能够通过增加有益细菌来调节微生物。有研究表明，干酪乳杆菌对于保护断奶仔猪的肠道具有很好的效果，同时提高了淋巴细胞的数目，增强了机体的免疫机能[9-10]。

本研究利用1%的植物乳杆菌在pH 值为7.0的条件下发酵新鲜苹果汁24 h 得到的发酵苹果汁处理腹泻小鼠，通过统计各组小鼠的稀便率以及对于小肠各段进行组织病理学观察，探讨发酵苹果汁对腹泻小鼠肠黏膜的作用和对小肠结构的完整性的影响，旨在为进一步深入研究发酵苹果汁的功能提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料 供试苹果为红富士，购自山西省晋中市山西农业大学农贸市场；植物乳杆菌CICC21809，购自中国工业微生物菌种保藏中心；供试动物为健康的SPF 级ICR 小鼠45 只，3 周龄、雄性，由山西医科大学提供。

1.1.2 试剂 头孢曲松钠，购自北京索莱宝有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵苹果汁的制备 将低温保藏的菌种活化后，在37 ℃培养箱中放置24 h，使菌液浓度达约1.0×107cfu/mL。新鲜苹果汁的pH 值在4.0 左右，通过食用碱（Na2CO3）调节苹果汁pH 值到6.5，121 ℃高压灭菌10 min；待果汁冷却后，在超净工作台上进行分装，根据不同发酵条件将其接种到50 mL 果汁中，接种后的苹果汁放置在37 ℃恒温箱内进行发酵培养。

1.2.2 乳酸菌发酵液的制备 将乳酸菌菌种活化后，接种于乳酸细菌发酵培养基（MRS）中，37 ℃培养24 h，使菌液浓度达约1.0×107cfu/mL。

1.2.3 动物分组及给药 将45 只小鼠适应性饲养7 d 后，随机分为5 个组（对照组、模型组、未发酵苹果汁组、发酵苹果汁组和乳酸菌组），每天对各组小鼠进行2 次灌胃，第1 次是在9：00，其中，对照组每只小鼠灌胃0.3 mL 的无菌生理盐水，模型组、未发酵苹果汁组、发酵苹果汁组和乳酸菌组每只小鼠各灌胃等量的头孢曲松钠溶液。第2 次是在4 h后，将各组每只小鼠单独放在一个鼠笼里，对照组和模型组每只小鼠灌胃0.3 mL 的无菌生理盐水，未发酵苹果汁组给予等量的新鲜苹果汁，发酵苹果汁组给予等量的发酵苹果汁，乳酸菌组灌胃等量的MRS 菌液；之后观察2 h，期间记录各组小鼠的稀便情况和正常的小鼠数量，并进行统计。第8 天将全部小鼠脱颈处死，并无菌收集各个小鼠的十二指肠、空肠和回肠，置于4%多聚甲醛中固定48 h，期间换一次固定液，保存于75%的乙醇中。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 稀便率测定 将各组的每只小鼠分别放置在一个鼠笼里，2 h 内统计每只小鼠的总排便数和所排稀便数，计算稀便率。

稀便率＝2 h 内所排稀便数/ 每只小鼠总排便数×100% （1）

1.3.2 肠道组织形态学观察 根据方磊涵等[11]的方法，无菌采集十二指肠、空肠和回肠，沿横截面横切成适当大小，生理盐水冲洗后固定，进行脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋流程，使用切片机切成5 μm厚的连续切片，挑选出完整的组织烘干后用于HE染色。染色时，先对切片进行二甲苯脱蜡，用梯度乙醇浸泡，再用苏木精染色5 min，自来水冲洗1 min后，利用1%的盐酸- 乙醇溶液来分色，再用自来水冲洗5 min；用梯度乙醇逐步脱水；在伊红染液中浸入30 s 后快速倒掉染液；再用高浓度的乙醇进行脱水，在二甲苯中透明20 min 后，中性树胶封片，放置过夜后在显微镜下观察并对完整的组织进行拍照。

1.4 数据处理

试验数据利用Graph Pad Prism 6.0 软件进行统计分析，稀便率采用One- way ANOVA 进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理小鼠稀便率的变化

从图1 可以看出，在第3 天，对照组及各试验组的小鼠与模型组相比均无显著性变化（P＞0.05）；第4 天时，对照组、乳酸菌组和发酵苹果汁组的小鼠与模型组相比，稀便率均显著下降（P＜0.05）；与发酵苹果汁组相比，未发酵苹果汁组稀便率显著上升（P＜0.05）；第5～7 天，各组小鼠的稀便率均无显著性变化（P＞0.05）。

2.2 不同处理小鼠十二指肠的形态学观察结果

从图2 可以看出，各试验组小鼠肠道具有明显的变化，在低倍镜下，对照组、未发酵苹果汁和发酵苹果汁组的十二指肠绒毛呈长指状和弯曲状，结构完整，绒毛与隐窝界限分明，无明显病理变化；而模型组出现肠绒毛的断裂、漂浮，隐窝和肠绒毛杂乱无序。

2.3 不同处理小鼠空肠的形态学观察结果

图3 结果显示，对照组、未发酵苹果汁组、益生菌组和发酵苹果汁组的肠绒毛排列整齐，与隐窝界限分明，无明显病理变化，且发酵苹果汁组的绒毛较长；模型组观察到肠绒毛的断裂缩短。

2.4 不同处理小鼠回肠的形态学观察结果

图4 结果显示，对照组、益生菌组、发酵苹果汁组的肠绒毛和隐窝排列紧密整齐，结构相对完整；模型组和未发酵果汁组能够看到明显的绒毛断裂和缩短。

3 结论与讨论

抗生素诱导的小鼠腹泻是构建动物腹泻模型最为常用的方法，通常都是小鼠灌胃7 d 左右即可形成。

仔猪腹泻是目前养殖场中常见的问题，吴苏君等[12]研究表明，仔猪腹泻与肠道菌群变化相关。绒毛是小肠最重要的黏膜组成部分，机体的各种消化吸收也是利用肠绒毛进行的[13]。因此，肠绒毛对于小肠的吸收功能具有最直接的作用。绒毛越长，说明消化吸收越强。隐窝是绒毛基部的上皮内陷形成的管状结构[14]，隐窝深度则反映了细胞的生成率和小肠的更新速度，更新过程减慢，就会导致隐窝变浅，表明成熟细胞较多，吸收消化能力增强[15]。

有研究证明，枯草芽孢杆菌能够增加成年的雄性鸡中的回肠绒毛长度，从而提高饲料转化率[16]。CHICHLOWSKI 等[17]用屎肠球菌处理肉鸡，结果显示，空肠和回肠的绒毛变长。当给动物喂乳杆菌后，黏膜出现了更多的褶皱，绒毛变长，增加了饲料的利用率[18]。郭元晟等[19]试验结果表明，乳酸杆菌对于肉鸡肠绒毛的增长具有促进作用。魏俊淑[20]研究表明，植物乳杆菌能够减缓葡聚糖硫酸钠诱导形成的结肠炎小鼠的肠道组织学损坏。本试验结果表明，发酵苹果汁能增加肠绒毛高度，促进小鼠肠黏膜的发育。小鼠腹泻后，肠道中的水分会变多，会促进粪便的软化，对肠黏膜也会产生一定的刺激，从而造成黏膜损害。小鼠灌服发酵苹果汁后，其肠绒毛损伤较轻，说明发酵苹果汁能够减轻腹泻对肠黏膜的刺激，对肠绒毛的完整性起到一定的保护作用。

本研究表明，与其他试验组相比，发酵苹果汁能够显著降低腹泻小鼠的稀便率，并且能够使腹泻模型小鼠的肠绒毛提高，说明发酵苹果汁在一定程度上能够保护肠黏膜，促进其生长，增加肠道黏液屏障的防御功能，减轻肠黏膜损伤，从而保护肠道。