SPME-GC-MS 法分析淡豆豉发酵过程中挥发性成分转化

隋利强，李 鸷，高 琳，许 文，徐 伟∗，褚克丹∗

（1.福建中医药大学，福建 福州350122；2.福建咸康药业有限公司，福建 福州350026）

淡豆豉是由豆科植物大豆Glycine max（L.）Meorr.的成熟种子和青蒿、桑叶经发酵加工而成的制品，具有解表除烦、宣发郁热等功效，具有抗氧化、降低胆固醇、保护心血管系统和神经系统、预防骨质疏松等多种生物活性，可用于肿瘤、心脑血管、骨质疏松症等疾病的预防和治疗，为药食两用品种［1-3］。福州地区淡豆豉发酵时需将桑叶、青蒿煎煮，煎液拌入净大豆中，蒸透后，稍凉，在25～28 ℃，相对湿度80% 左右的条件下发酵至黄衣上遍，取出，洗净，晒干。在淡豆豉制备过程中，青蒿和桑叶作为共同发酵的基质，其中某些成分被分解和利用转化成其他有效成分，部分成分也可以刺激菌丝生长和生物活性物质产生［4］。

淡豆豉发酵过程伴随着多种化学物质的转化，目前已知，淡豆豉发酵过程变化最为明显的是黄酮苷类，如大豆苷、染料木苷、黄豆黄苷会转化为大豆苷元、染料木素、黄豆黄素，此外，淡豆豉发酵过程还产生一种具有溶栓作用的纤溶酶［5］。淡豆豉发酵过程的挥发性成分转化未见报道。

在前期实验中，观察到淡豆豉经发酵后气味变化明显，推测与挥发性成分变化有关。但是淡豆豉挥发性成分含有量较低，无法用常规方法进行分析，固相微萃取气质联用技术技术，适用于挥发性成分含有量低的物质的检测［6-9］。本实验采用SPME-GC-MS 法分析淡豆豉发酵过程中挥发性成分的转化，以期为其炮制原理研究提供参考。

1 材料

全二维气相色谱-高分辨飞行时间质谱联用仪（美国Leco 公司）。黑豆由咸康药业有限公司提供，经福建中医药大学车苏容副教授鉴定为豆科植物大豆Glycine m ax（L.）Meorr.的成熟种子。桑叶、青蒿由咸康药业提供，经福建中医药大学车苏容副教授鉴定桑叶为桑科植物桑Morus albaL.的干燥叶，青蒿为菊科植物黄花蒿Artemisia annuaL.的干燥地上部分。淡豆豉为咸康药业有限公司上述同批原料制备的成品，收集5批样品，经福建中医药大学车苏容副教授鉴定为豆科植物大豆Glycine max（L.）Merr.的成熟种子的发酵加工品。

2 方法与结果

2.1 挥发性成分提取 分别精密称取2.0 g 黑豆、淡豆豉、桑叶、青蒿粉末于100 mL 的顶空瓶中，快速密封，并将其置于恒温水浴的设备中，90 ℃下预热30 min。将老化过的65 μm PDMS／DVB 的固相微萃取伸入到顶空瓶中，推出萃取头，再顶空萃取60 min，将固相微萃取的装置迅速伸入GC-MS 进样口，于250 ℃下脱附5 min 进行分析。萃取样品前，萃取头均应在250 ℃下老化15 min［10-11］。

2.2 GC-MS 分析

2.2.1 GC-MS 条件 DB-5MS 石英弹性毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气He；进样口温度250 ℃；不采用分流进样；程序升温（50 ℃的温度保持2 min，再以3.0 ℃／min的速度升温至220 ℃，保持4 min）；体积流量1 mL／min；解析4 min［12-14］。

电离方式EI；电子能量70 ev；离子源230 ℃；接口230 ℃；溶剂延迟时间3.0 min；质量扫描范围m／z30～550。

2.2.2 GC-MS 分析 按“2.2.1”项下方法分析收集挥发性成分，通过GC-MS 分析并检索比对NIST Version1.7图谱库，鉴定出各样品的化学成分，采用峰面积归一化法求得各化学成分的相对质量分数。见表1。

表1 各样品挥发性成分测定结果

续表1

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3 讨论

通过SPME-GC-MS 分析鉴定的化合物主要为烷烃类、酯类、醛类、酚类等。其中黑豆、淡豆豉、桑叶、青蒿中分别检测出挥发性成分84、72、80、84种。其中，黑豆与淡豆豉共有成分20种，黑豆独有成分52种，淡豆豉独有成分40种。经淡豆豉与黑豆挥发性成分比较，发现淡豆豉发酵过程出现差异成分中，12种差异成分来自桑叶和青蒿，另外40种差异成分与发酵过程有关。对福建咸康药业有限公司生产的5批淡豆豉进行分析，上述结果稳定、重复性较好。维恩图见图1。

图1 各样品挥发性成分分布维恩图

淡豆豉发酵过程，挥发性成分变化较大，棕榈酸、氧化喇叭烯、β-金合欢烯、β-芹子烯等经发酵后消失，也产生出新物质如α-蒎烯、氧化香橙烯、β-法尼烯、α-芹子烯等。黑豆中的β-芹子烯，淡豆豉中的α-芹子烯互为同分异构体，可能与发酵转化相关。其中，发酵过程产生的东莨菪内酯可保护肝纤维化大鼠肝脏，改善大鼠肝纤维化病变过程，具有抗肝纤维化作用［15］；发酵过程含有量明显增加的丹皮酚药理活性广泛，可干预大鼠动脉粥样硬化的形成，具有抗氧化、抗炎、镇痛等活性［16］。其中，抗炎、镇痛作用与淡豆豉的解热，用于治疗感冒、寒热头痛。

青蒿中检测到脱氧青蒿素含有量为0.893%，3-脱氧双氢青蒿素含有量为0.317%，而淡豆豉中检测到脱氧青蒿素含有量为0.966%，高于青蒿中的含有量，3-脱氧双氢青蒿素在淡豆豉中未检测到。淡豆豉中脱氧青蒿素含有量的升高，推测原因为淡豆豉中挥发性成分种类和含有量较青蒿稍少，脱氧青蒿素在同等含有量下含有量可能会升高；再者发酵过程中青蒿素类成分可能发生转化，如3-脱氧双氢青蒿素转化为脱氧青蒿素。3-脱氧双氢青蒿素在豆豉中未检测到，可能在制备辅料过程中，3-脱氧双氢青蒿素流失；且发酵过程3-双氢青蒿素可能发生转化。上述推测有待于进一步验证。青蒿入药可清热、解暑、截疟、凉血、利尿、健胃、止盗汗。可煎汤、入丸散口服，也可捣敷或研磨调敷外用。青蒿素类成分是青蒿中非常重要的一类药效成分，具有抗疟、抗肿瘤、抑菌杀虫、抗炎及免疫调节、抗纤维化、抑制脂肪变性等作用，还可抑制胃癌细胞增殖，促进其凋亡，而汤剂对青蒿素类成分的利用率较低［17-18］。若改变淡豆豉的服药途径，如以丸、散剂的形式服用有可能更好的发挥青蒿中青蒿素类成分的作用。

本研究通过顶空固相微萃取法提取淡豆豉原料及成品的挥发性成分，GC-MS 进行成分分析，检测到淡豆豉发酵过程中部分挥发性成分的转化，由于毛细管内部涂层和萃取纤维头的选择性，所测化合物数量和种类只能反应大部分淡豆豉发酵过程的挥发性成分的转化，少数化合物可能在该萃取条件和检测条件下无法测得。如果要全面反应淡豆豉发酵过程的挥发性成分转化，可尝试不同类型涂层的毛细管和纤维萃取头，获得更全面的信息。此外，可结合LC-MS 等分析方法对淡豆豉发酵过程成分转化进行分析，进一步探讨淡豆豉发酵炮制原理。