基于SDS-PAGE与荧光标记检测技术的黄淮麦区小麦品种(系)HMW-GS组成分析

贾琳琳，王永霞，靳晓杰

(河南省农业科学院 作物设计中心，河南 郑州 450002)

随着我国经济的发展和人民生活水平的不断提高，人们对小麦品质的要求越来越高，小麦品质改良已成为小麦育种工作的重要研究方向。在影响小麦品质的众多因素中，高分子质量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)对小麦面粉加工品质起关键作用[1-2]，其组成已成为品质育种中亲本选配和杂交后代选择的重要依据。HMW-GS由第一部分同源染色体长臂上的Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点编码[3]。每个位点都含有2个紧密连锁基因，分别编码分子质量较大的x型和分子质量较小的y型亚基。到目前为止，已经发现并命名的亚基超过40种。公认的优质HMW-GS有1、2*、7+8、14+15、13+16、5+10等，优质亚基组合有1/14+15(13+16)/5+10、1/7+8/5+10、1/17+18/2+12等[4-8]。研究表明，我国小麦品种的HMW-GS组成较丰富，但优质亚基频率较低，同时含有多个优质亚基组合的品种也较少，品质仍较差[9-11]。因此，筛选含有优质HMW-GS和亚基组合的材料成为提高小麦面粉加工品质的关键。

检测小麦HMW-GS的方法主要有SDS-PAGE[5]、分子标记[12]和高效毛细管电泳[13]等。其中，SDS-PAGE是最常用的方法，并得到了广泛应用，分子标记可辅助SDS-PAGE有效鉴定HMW-GS多样性。分子标记可以直接对HMW-GS 基因进行检测，不受植株发育时期、取材部位的限制，具有其独特的优越性。编码HMW-GS的基因具有高度的同源性，每个基因位点都存在大量的等位变异，不同等位基因之间的差异由DNA序列的重复和缺失造成。国内外诸多学者根据其特点设计出特异性、保守性引物，可快速、准确地检测HMW-GS基因[14-17]。LEI等[14]针对Glu-B1位点编码区域DNA序列变异设计出特异性引物，可有效鉴定By7、By8、By9基因。LIU等[15]在前人研究的基础上，在Glu-A1、Glu-D1位点上设计出共显性标记UMN19、UMN25、UMN26，可分别鉴定Ax2*、Ax1、null，Dx2、Dx5，Dy10、Dy12基因。此外，已开发分子标记的基因还有Bx7*、Bx7OE、By8*、By16等[16]。毛细管电泳荧光标记检测法是一种快速、准确、高效的分子标记检测方法，能极大提高工作效率，增强试验结果的稳定性和可重复性。郑永胜等[17-18]利用该方法建立了小麦品种DNA指纹鉴定体系，并利用81个SSR标记对96份小麦品种进行了相似度分析。目前，将凝胶电泳与分子标记相结合进行小麦HMW-GS检测的研究很少，且分子标记检测的方法均为琼脂糖凝胶电泳[19-21]，而同时使用SDS-PAGE和毛细管电泳荧光标记检测的研究尚未见报道。为此，利用SDS-PAGE和荧光标记法同时对91份黄淮麦区小麦品种(系)的HMW-GS组成进行分析，以期为黄淮麦区小麦品质改良提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为91份黄淮麦区小麦品种(系)，包括68份品种和23份品系(表1)，分别来自河南省、河北省、山东省等地，以中国春(Null/7+8/2+12)、师栾02-1(1/7+9/5+10)、石4185(1/14+15/2+12)为对照材料。其中，师栾02-1和石4185由河北省农林科学院张颖君惠赠，其余材料均由河南省农业科学院作物设计中心提供。

表1 小麦品种(系)名称及来源Tab.1 Wheat varieties(lines) name and source

续表1 小麦品种(系)名称及来源Tab.1(Continued) Wheat varieties(lines)name and source

1.2 试验方法

1.2.1 HMW-GS 提取 HMW-GS样品提取参考PENG等[22]的方法。每份样品取10粒种子磨粉后，称取20 mg 置于2 mL 离心管中，加入1 mL样品提取液[62.5 mmol/L Tris-HCl (pH值6.8)、0.002%溴酚蓝、10%甘油、1.5%二硫苏糖醇、2% SDS]65 ℃水浴浸提30 min，涡旋5 min，取出冷至室温，9 000×g离心5 min，取上清保存于4 ℃冰箱。

1.2.2 SDS-PAGE电泳 采用10%(pH值 8.8)的分离胶和4%(pH 值6.8)的堆积胶，用甘氨酸溶液为电极缓冲液，单板电流15 mA，电压100 V，电泳8 h，用考马斯亮蓝R250染色液染色过夜，蒸馏水脱色至条带清晰，拍照保存。参照 PAYNE等[23]的亚基命名及编号方法对亚基进行记录。

1.2.3 毛细管电泳荧光标记检测 采用CTAB法从幼苗叶片中提取供试材料的基因组DNA。PCR反应体系总体积为10 μL：dNTPs(25 mmol/L)0.15 μL、上游引物(10 μmol/L)0.15 μL、下游引物(10 μmol/L)0.3 μL、M13荧光标记引物(10 μmol/L)0.15 μL、Taq酶 0.15 μL、10×Buffer 1 μL、模板60 ng，用去离子水补足至10 μL。本研究涉及的引物为UMN19、UMN25、UMN26，其中上游引物前端加有M13的尾巴序列(5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′)，由生工(上海)生物工程有限公司合成，M13荧光标记引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成(表2)。

表2 荧光标记引物信息Tab.2 The information of fluorescent labeled primers

PCR扩增反应在Eppendorf Mastercycler®pro 384扩增仪上进行，PCR扩增程序参照LIU等[15]的方法。PCR结束后，每孔加7 μL甲酰胺于95 ℃变性5 min，在ABI 3500XL上进行荧光检测，结果利用Genograper 2.1软件进行分析。

1.2.4 品质评分和聚类分析 HMW-GS评分标准参照宋建民等[24]的方法，目的条带存在时赋值为1，不存在时赋值为0，根据1、0数据构建矩阵，计算遗传相似系数，利用软件NTSYS 2.1中UPGMA进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 基于SDS-PAGE检测的小麦品种(系)HMW-GS组成分析

SDS-PAGE检测结果显示，供试小麦材料共含有14种HMW-GS类型，表现出丰富的变异(表3—4)。Glu-A1位点上共有1、Null、2*三种亚基类型，出现频率分别为59.34%、37.36、3.30%。Glu-B1位点上共有5种亚基类型，分别为7、7+8、7+9、13+16、14+15。其中，7+8的频率最高(52.75%)，其次为7+9(25.27%)，携带稀有亚基7、13+16、14+15的材料有19份。Glu-D1位点亚基变异较丰富，共出现6种亚基类型，除所占比例较高的2+12和5+10亚基外，还有10、12、3+12、4+12稀有亚基，特别是3+12和4+12亚基，累计出现比例高达21.98%，说明近年来更多的亚基类型被用于小麦品质改良育种。

2.2 基于荧光标记检测的小麦品种(系)HMW-GS组成分析

荧光标记检测结果(部分结果见图1)显示，91份供试小麦材料中含Ax1、Null基因的材料较多，含Ax2*基因的材料有3份；含Dx2、Dx5基因的材料各有42、27份，比例分别为46.15%、29.67%；周麦18等63份材料含有Dy12基因，28份材料含有Dy10基因。综上，荧光标记检测结果与SDS-PAGE检测结果相吻合，说明亚基特异性分子标记可准确、快速地检测小麦中HMW-GS基因。

表3 基于SDS-PAGE检测的91份小麦品种(系)的HMW-GS组成分析

续表3 基于SDS-PAGE检测的91份小麦品种(系)的HMW-GS组成分析

表4 基于SDS-PAGE检测的小麦品种(系)HMW-GS等位变异及频率分析Tab.4 Allelic variation and frequency analysis of HMW-GS in 91 wheat varieties (lines) based on SDS-PAGE

1—18为品种(系)编号(同表1)1—18 are varieties(lines)number(the same as Tab.1)

2.3 小麦品种(系)HMW-GS组合及其频率、品质分析

由表5可知，在91份供试小麦材料中，共检测出28种HMW-GS组合，表现出丰富的HMW-GS组成多样性。其中，适合制作面包的优质亚基组合类型1/7+8/5+10出现频率最高，为14.29%；其次是适合制作优质手工馒头的亚基组合1/7+8/2+12和Null/7+8/2+12，均为12.09%；15个亚基组合出现频率较低，均为1.10%。

由表5可知，供试材料得分介于5.5～11.0，平均得分为7.78，由于10、12亚基的品质评分未见报道，暂不对含有这些亚基的组合进行评分，且含有这2个亚基的材料均只有1份，对总体评分影响不大。Null/13+16/5+10组合得分最高(11.0分)，分别来自泉麦28、小偃6号、龙科1109。品质评分在9分及以上的亚基组合有1/13+16/2+12、1/7+8(7+9)/5+10、Null/13+16/2+12、Null/14+15/5+10。

表5 供试小麦品种(系)HMW-GS组合类型及其频率、品质得分

2.4 基于HMW-GS的小麦品种(系)聚类分析

由图2可知，在遗传相似系数为0.42时，可以将供试材料分为4大类：第Ⅰ类包括03中42、衡562、沧麦6001、泉麦28，小偃6号和龙科1109等6份材料，其Glu-B1位点上的亚基类型为13+16，亚基组合所得品质评分相对较高；第Ⅱ类包括2份材料，分别为良星66和平安11，其Glu-B1位点上的亚基类型为稀有亚基14+15；第Ⅲ类包括22个材料，其Glu-D1位点上的亚基类型为优质亚基 5+10，该类集中了大部分强筋小麦材料，如新麦26、郑麦7698和郑麦366等；第Ⅳ类可以分为3个亚类，第一亚类包括28份材料，第二亚类包括7份材料，第三亚类包括23份材料。

图2 基于HMW-GS的91个小麦品种(系)的聚类分析

3 结论与讨论

黄淮麦区是我国小麦的主产区，该区域小麦HMW-GS等位基因和亚基组合的多态性较丰富，但分布均严重不均。优质亚基5+10和14+15所占比例有所提高，但优质亚基组合所占比例仍然很低[25]。麻珊珊等[26]对参加黄淮麦区南片冬、春小麦预备试验的143个小麦新品种(系)HMW-GS组成进行分析，发现了10种等位基因和15种亚基组合，对加工品质具有正效应的优质亚基1出现的频率为59.44%，14+15出现频率为13.99%，5+10出现频率为37.06%，谢科军等[27]、李立等[28]研究结果与之相似。本研究也得到相似的结果，在随机选取来源不同的小麦品种(系)中，优质亚基1(59.34%)和5+10(29.67%)出现频率依然较高，14+15出现频率则没有提高。本研究中除检测到1、7+8、2+12、5+10等所占比例较高的亚基外，还发现一些稀有优质亚基，如2*、13+16、14+15等，极大地丰富了黄淮麦区小麦的HMW-GS类型，说明近年来人们开始注重不同优质亚基材料的引进、筛选和利用。供试材料的平均品质得分较张瑞奇等[29]研究结果有所提高，品质评分在9.0分及以上的亚基组合有1/13+16/2+12、1/7+8(7+9)/5+10、Null/13+16/2+12、Null/14+15/5+10。其中，Null/13+16/5+10亚基组合出现频率较低(3.30%)，但它们的品质评分最高(11.0分)；优质亚基组合1/7+8/5+10出现品频率最高(14.29%)，其品质评分高达9.5分。小麦的品质育种过程中应加强对优异种质的利用，本研究所筛选出来的含有1、2*、5+10、13+16、14+15等优质亚基和亚基组合的品种(系)可作为杂交亲本和转育材料，用于黄淮麦区小麦定向品质改良育种。

SDS-PAGE是分离检测HMW-GS最常用的方法，在国内各育种单位得到了广泛应用，对加速小麦品质育种做出很大的贡献。SDS-PAGE法具有一定的局限性，如需要用收获后的籽粒作为材料，且电泳图谱上亚基的迁移率与分子质量并不总是一致，从而混淆分子质量不同而迁移率相似的亚基等。利用分子标记进行HMW-GS鉴定，克服了SDS-PAGE方法的局限性，可在不同的生育时期进行取样，可以快速大量地检测相关基因，因而受到了广泛的重视。白升升等[21]利用分子标记有效鉴定了迁移率相近的7、7*与7OE,8与8*亚基，准确分析了小麦HMW-GS类型。本研究中分子标记检测结果与SDS-PAGE检测结果相吻合，说明利用分子标记技术可有效鉴定材料中HMW-GS。此外，本研究采用的毛细管电泳荧光标记检测技术，相比之前的琼脂糖凝胶电泳和普通的SDS-PAGE，具有高通量、高灵敏度、分析过程自动化等优点，适用于大规模材料的分析研究。试验过程中合理搭配扩增片段差异较大的同种荧光标记，实现多荧光多目的片段PCR产物的同时检测，提高基因型鉴定效率，有效降低了鉴定成本。