普通小麦 TaZIP29-7B 基因的克隆及表达研究

张嘉程，高 翔，，董 剑，，杨明明,，李晓燕,，赵万春,

(1.西北农林科技大学 农学院，陕西杨凌 712100; 2.陕西省小麦工程技术研究中心/陕西省小麦新品种培育工程研究中心，陕西杨凌 712100)

小麦作为人类主要粮食作物之一，其种植环境也受到巨大挑战，例如高温、干旱、冻害、盐胁迫及重金属污染等。金属离子在植物的生长发育过程中起到极其重要的作用，但如果吸收过量会导致体内蛋白结构发生不可逆的改变，从而影响植物的正常生长发育。

锌和铁是生物体所必需的微量元素，在植物的生长发育过程中有着重要作用[1]。锌不仅参与机体的各种代谢，在生物膜稳定和基因表达调控等生理机能中也担负着重要角色[2]，它还是生物体内多种酶和蛋白质的结构辅助因子。适量增加植物体内的锌可提高作物产量，而锌的缺乏或过量都会导致叶绿素、脂质、蛋白、质膜的氧化破坏，例如过量的锌会破坏小麦体内活性氧清除系统造成MDA 积累，细胞膜透性变大，致使细胞内酶及代谢作用区域受到破坏[3]。铁在细胞呼吸、光合作用和金属蛋白的催化反应过程中发挥重要作用，是重要的电子传递体[4]。因此，铁在原核和真核生物的新陈代谢过程中有着无法替换的作用。但是细胞内过高的 Fe3+/Fe2+氧化还原势会导致超氧化合物的产生，对细胞造成伤害[5]。因此，保证植物体内的各种金属离子的平衡对植物的正常生长是非常必要的，这一过程要依靠多种转运体的共同参与，包括锌、铁转运体蛋白家族(Zinc-regulated transporters，Iron-regulated transporter-like proteins，ZIP)、自然抗性相关巨噬蛋白家族(The natural resistance associated macrophage protein，NRAMP)、阳离子扩散辅助蛋白家族(Cation diffusion facilitator proteins，CDF)、植物重金属 ATP 酶家族 P1B-ATPase(Heavy metal ATPa-ses，HMA)、黄色条纹蛋白家族(yellow stripe-like，YSL)和三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cass-ette transporter),这些运输蛋白对于植物锌铁吸收、体内分配以及维持细胞内锌铁离子的平衡具有重要作用[6-7]。

目前在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)、玉米(Zeamays)等少数植物中对ZIP的研究比较多。ZIP基因家族的功能分析表明，该基因家族在从胞外向胞内转运并在胞内进行锌运输过程中起重要作用[1]。酵母功能互补试验显示ZIP家族基因能够转运包括Zn2+、Fe2+、Cu2+、Cd2+在内的多种金属离子[8]。AtIRT3能互补锌、铁转运双突变体，过表达AtIRT3会使锌在地上部、铁在地下部积累[9]。在研究水稻ZIP家族基因时研究人员发现，OsIRT1过表达可使地上部、地下部和成熟种子中的锌、铁含量提高[10]。拟南芥中发现的多种ZIP家族基因中AtIRT2主要在根部表达，定位在囊泡，推测具有细胞内过量金属元素的解毒功能[11-12]。OsIRT1参与镉的运输，并且OsIRT1过表达材料提高了植株对过量锌和镉的敏感性[13]。在缺铜诱导下，AtZIP2和AtZIP5在根部表达[14]，证明这2个基因都参与了Cu2+的转运。研究转运蛋白功能时，一般情况下，同源基因具有类似的转运模式的可能性比较大，但在ZIP家族中，由于其他物种与水稻生存环境的差异或者其他因素，造成同源基因的功能存在差异，例如OsZIP8受锌诱导表达，过表达后会导致锌在水稻体内再分配，但在拟南芥中，ZIP8转运蛋白对锌，铁，锰，铜可能都无转运活性[15]。AtZTP29定位在内质网膜上，内质网膜在盐胁迫下会产生未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，AtZTP29在参与响应盐胁迫的过程中，是通过调节UPR所需的锌离子而产生作用[16]。

本研究克隆了小麦TaZIP29-7B基因，并利用生物信息学软件以及在线分析，对此基因的相关信息及其编码蛋白进行初步分析，并对启动子区顺式作用元件做一个简单的预测，再利用实时荧光定量PCR技术分析TaZIP29-7B基因在不同重金属溶液处理下，其在根系及地上部分的表达特征，为进一步发掘探索该基因的功能机制做出预测。

1 材料与方法

1.1 材 料

小麦‘西农538’由西北农林科技大学农学院高翔老师课题组提供。挑出残缺的种子，用清水洗去杂质，用质量分数为1%的H2O2处理10 min，再用体积分数为70%酒精消毒处理5 min，再用蒸馏水冲洗4次，冲洗干净，加水室温下放置萌发，待种子萌发露白时期，选取部分摆放至铺有滤纸的培养皿中，放置恒温培养箱中。待其生长至两叶一心期时，给予含有重金属的溶液的处理，然后置于室温光照条件下培养。重金属种类为锌、铁、铜、镉，质量浓度设置为200 mg/L，分别处理1、3、6、12、24 h。取叶片及根系样品后及时用液氮处理，并保存于-80 ℃备用。

1.2 RNA提取及其cDNA第一链合成

利用试剂盒RNAprep Pure Plant Kit(天根，北京)提取RNA后，然后检测所提取的RNA的完整性后，再通过测定浓度的仪器NanoDropTM One(Thermo Scientific，美国)检测所提取的RNA浓度，最后再使用试剂盒Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)进行cDNA合成。

1.3 TaZIP29-7B 基因及其启动子克隆

根据NCBI ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布的拟南芥AtZTP29基因(GenBank登录号:AT3G20870)序列在在线网站Ensembl Plant(http://plants.ensembl.org/index.html)进行比对，将得到的结果利用引物设计软件Primer设计特异性引物T25-F、T25-R(表1)，以‘西农538’ cDNA为模板进行扩增，PCR体系和程序设置根据2×EsTaqMasterMix(康为世纪，北京)的说明书进行设计，循环数为32，退火温度为67 ℃，延伸时间1 min，体系15 μL，产物4 ℃下保存。凝胶电泳检测条带大小正确后进行PCR产物回收，并和克隆载体pEASY-T1(全式金，北京)进行连接，转化大肠杆菌，涂至汉卡那抗生素的LB固体培养基中，37 ℃条件下倒置培养。挑取单克隆菌落，菌液PCR检测条带大小正确后，在含卡那(50 mg/L)抗生素的液体培养基中过夜培养后，送公司进行测序，测序结果进行在线比对分析以及利用软件DNAman进行相关分析。

利用在线网站Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)上寻找TaZIP29-7B基因的上游2 500 bp左右大小的序列，并设计特异性引物Q1-F和Q1-R(表1)进行扩增。PCR体系和程序设置根据2×EsTaqMasterMix(康为世纪，北京)的说明书进行设计，循环数为32，退火温度为66 ℃，延伸时间2 min，体系15 μL，产物4 ℃下保存。利用在线软件Promoter 2.0 Prediction Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)在线预测启动子区，以及PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 对启动区的预测结果进行进一步关于其顺式调控元件的分析。

1.4 TaZIP29-7B 基因生物信息学分析

利用NCBI ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在线工具对目的基因的ORF进行分析和并查找该基因的编码蛋白，利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在线对该基因编码的蛋白保守结构域预测，使用软件Bioedit、ExPASy-ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)、SWISSMODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)、CBS-TargetP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)进行编码蛋白的理化性质以及亲水性/疏水性以及对蛋白质三级结构的预测和亚细胞定位预测分析，通过TMpred(https://embnet.vital-it.ch/cgi-bin/TMPRED_form_parser)在线分析蛋白质的跨膜区。利用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)对目的基因的外显子-内含子结构进行预测分析。最后通过NCBI-Blastp程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对TaZIP29-7B基因编码氨基酸的同源性进行分析，然后下载不同植物的ZIP蛋白序列信息，并运用ClustalX软件对该基因的氨基酸序列和其他物种锌铁转运蛋白的氨基酸序列进行多重比对，并利用软件MEGA6.0构建系统进化树。

1.5 TaZIP29-7B 基因表达分析

根据所得序列结果设计荧光定量引物QRT4-F,QRT4-R以及内参基因Nc-F,Nc-R(表1)。利用荧光定量仪QuantStudioTM7 Flex(ABI Q7，美国)进行qRT-PCR，体系及程序设置参照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus) (TaKaRa，日本)说明书进行，体系20 μL，循环数40，退火温度 60 ℃，时间32 s。实验设置3次重复，以保证准确性。利用2-ΔΔCT法计算TaZIP29-7B基因的相对表达量。

表1 引物信息Table 1 Primers information

2 结果与分析

2.1 TaZIP29-7B 基因的获得及基本分析

2.1.1TaZIP29-7B基因的分析 以‘西农538’的cDNA为模板，以特异性引物T25-F，T25-R进行扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，得到1 000 bp左右出现目的条带，进行切胶回收后，连接转化并测序，得到序列长度为896 bp的序列片段，利用NCBI ORF Finder在线比对分析得到834 bp大小的基因编码区。将所得目的条带的序列命名为TaZIP29-7B，并提交到NCBI数据库中，获得其反馈的序列登录号：MK203894。利用GSDS 2.0对TaZIP29-7BcDNA基因序列与基因组DNA序列进行比对后分析结果显示，该基因含有10个外显子和9个内含子(图2)。

2.1.2TaZIP29-7B基因编码蛋白的分析 NCBI-ORF对TaZIP29-7B基因的ORF进行了预测，得到一段长834 bp的ORF，编码277个氨基酸。ExPASy-ProtParam对蛋白的理化性质分析得到蛋白不稳定指数为40.45，此种蛋白不稳定，理论等电点6.30，总平均亲水性0.715，是一种疏水性蛋白(图3)。根据TargetP 1.1 在线分析反馈结果可知，目的蛋白TaZIP29-7B蛋白定在细胞膜上，属于分泌通路蛋白，通过SignalP 4.1对TaZIP29-7B蛋白进行信号肽分析，结果显示目的蛋白存在信号肽，属于分泌蛋白，与TargetP 1.1分析结果相符合。SMART蛋白的保守结构域预测，得到一个位于目的蛋白第89～263位置间的结构功能域ZIP，属于典型的ZIP超级家族结构域，参与金属离子的跨膜转运，对植物体内的金属离子的积累和平衡有着重要的作用，符合预期结果。蛋白质三级结构分析结果如图4所示，含有多个α螺旋，TMHMM分析结果显示(图5)，此蛋白有8个跨膜区，在第三到第四跨膜区之间，存在一个位于细胞内的可变区，这一部分区域含有的完全保守的组氨酸残基，可能与金属离子的结合与运转有关。

M. Trans 2K DNA marker;1.TaZIP29-7BcDNA扩增产物 The amplicon ofTaZIP29-7Bfrom cDNA;；2.TaZIP29-7B启动子扩增产物 The amplicon ofTaZIP29-7Bpromoter

图1TaZIP29-7B基因PCR扩增产物的电泳结果
Fig.1 PCR amplification ofTaZIP29-7Bgene detected by agarose gel electrophoresis

图2 TaZIP29-7B 基因结构分析Fig.2 Structure analysis of TaZIP29-7B gene

图3 蛋白质疏水性分析结果Fig.3 Protein hydrophobicity analysis results

图4 蛋白质三级结构预测图Fig.4 Protein tertiary structure prediction map

2.1.3 进化树构建 利用MEGA 4.0对将山羊草(XP_020178053.1)、二穗短柄草(XP_010234219.1)、乌拉尔图小麦(EMS47420.1)、玉米(XP_008644450.1)、小米(XP_004972374.1)、糜子(RLM61625.1)、粳稻(XP_015649148.1)等植物的ZIP同源蛋白与TaZIP29-7B蛋白进行比对分析，比对分析结果显示(图6)，不同植物之间的锌铁转运蛋白具有高度的同源性，相似度 89.94%～100%，而与小麦的同源蛋白高度一致，是具有高度保守性的。差异较大部分主要体现在第三与第四跨膜区间胞内部分的可变区，但是相同点在于此处范围内具有组氨酸。可变区内的组氨酸是和金属离子的结合以及转运有关的。在与其它科属的植物的锌铁转运蛋白比对的结果中同样发现具有较大的相似性在67.87%～70.76%，所以在不同植物之间是存在较大差异的，但是其所行使的作用是基本相似的。利用MEGA6.0采用的NJ法进行进化树构建(图7)，分析结果表明，本研究得到的TaZIP29-7B蛋白与山羊草、乌拉尔图小麦、二穗短柄草的亲缘关系最近。

图5 跨膜区分析结果Fig.5 Transmembrane region analysis results

红色方框代表ZIP家族独特的氨基酸残基 Red squares represent unique amino acid residues in the ZIP family；Ta.小麦TriticumaestivumL.；Aet. 山羊草Aegilopstauschiisubsp.tauschii；Bd. 二穗短柄草Brachypodiumdistachyon；Zm.玉米Zeamays；Si.小米Setariaitalica；Pm.糜子Panicummiliaceum；Os.粳稻OryzasativaJaponica Group；Tu.乌拉尔图小麦Triticumurartu

图6 小麦TaZIP29-7B不同植物间ZIP同源蛋白比对结果
Fig.6 Sequence alignment of amino acid residues of TaZIP29-7B with other related proteins

2.2 启动子克隆及其预测结果分析

以‘西农538’的cDNA为模板，以Q1-F/Q1-R为引物得到TaZIP29-7B基因的上游序列，测序结果比对正确后，再次电泳检测(图1)，对所得序列进行启动子区的分析，得到起始密码子上游 1 600 bp的序列为启动子区，转录起始位点预测结果显示含有4个位点(图8)。利用PlantCARE对启动子作用元件进行分析，分析结果发现(图9)，除了启动子中常见的多种顺式作用元件如CAAT-box，TATA-box外，还发现其含有多种与抗逆相关的作用元件，例如参与脱落酸反应的元件ABRE，参与赤霉素反应性的顺式作用元件TATC-box，参与MeJA(茉莉酸甲酯)反应性的顺式作用调节元件TGACG-motif，还有依赖ABA的MYC和MYB作用元件，参与干旱诱导的MYB结合位点MBS，常见的应激反应元件STRE，以及还发现多种参与光响应的顺式作用调节元件如Sp-1、G-Box、chs-Unit 1 m1。

TaZIP29-7B 基因的编码蛋自 The deduced proteins of TaZIP29-7B gene obtained in this study.

加粗字符表示预测的转录起始位点 Bold characters indicate predicted transcription start sites

2.3 TaZIP29-7B 基因表达结果分析

小麦苗期在4种不同重金属，相同的浓度条件下，在处理不同时间后，最终的检测结果表明TaZIP29-7B在根和叶组织中均有表达，但表达量不一致。

小麦苗在200 mg/L CdCl2、CuSO4溶液处理下(图10-A,B)，根系TaZIP29-7B基因表达量呈现出相同的变化趋势，在1 h内迅速上升，然后在其后的23 h内，TaZIP29-7B的表达量表现出波浪形的变化，并在24 h达到第三个峰值，表达量与对照组相比，大概为两倍的差异，而出现这种变化趋势，可能与其体内重金属离子的动态平衡有关。在ZnSO4溶液处理下(图10-C)，TaZIP29-7B表达量迅速升高，在3 h时表达量降低到开始一般的水平，在12 h时达到第二个顶峰，在不间断的处理下，表达量随后又下降到最低的水平，基本与对照组相同。在FeSO4溶液处理下(图10-D)，TaZIP29-7B的表达量并没有像其他3种处理条件下的迅速升高，而是不断上升，在6 h时达到顶点，随后又缓慢下降，上升与下降的速率基本相似，但是最后的表达量依旧是高于对照组。相比锌离子处理下的反应，铁离子的处理下TaZIP29-7B基因的表达量并不是很迅速，猜测原因在于TaZIP29-7B蛋白与锌离子的亲和性比与铁离子的要大，所以在锌离子处理3 h后其体内的TaZIP29-7B表达量就迅速降低的与对照组一致的水平。也能进一步推测锌离子和铁离子在植物体内的变化情况，锌离子能够较快吸收并迅速达到动态平衡，而TaZIP29-7B基因针对铁离子的响应则较为缓慢。

图9 TaZIP29-7B启动子序列预测元件分析Fig.9 Predicted cis-elements in the promoter of TaZIP29-7B

在与上述溶液相同浓度的条件下，经CdCl2，ZnSO4溶液分别处理小麦苗后(图11-A,B)，叶片内TaZIP29-7B基因的表达量变化趋势呈现一致，先迅速升高，随后在3 h后迅速降低，然后又在6 h时达到2个处理下的最大值，然后又一次缓慢降低，最终在24 h时处在一个较低的表达量时期。由于镉离子的毒害较大，在24 h时植株的表型已经明显表现出其生长生理代谢严重受损，从而在24 h时TaZIP29-7B基因表达量直接降低到与对照组相同的水平。

在FeSO4、CuSO4溶液处理下(图11-C,D)，叶片中TaZIP29-7B基因表达量的变化趋势呈现出完全相反的状态，在FeSO4溶液处理下，表达量随着时间的增加而缓慢增大，在6 h时处在最高峰值，随之下降，但是在24 h时TaZIP29-7B基因表达量依旧是高于对照组的，而在CuSO4溶液处理的过程中，TaZIP29-7B基因表达量先是缓慢下降，直到在6 h时达到最低值，而后又一路升高，在24 h时达到此种处理下的峰值，并且较对照组的表达量高出一倍有余，也证明了TaZIP29-7B蛋白参与了Cd2+、Cu2+的转运。

3 讨 论

在重金属胁迫下，小麦的生长受到严重影响，细胞膜系统会首先受到损伤，但如果其他对植物生长具有重要作用的离子过量，依旧会对小麦的正常生长产生不良影响。本研究成功克隆出小麦TaZIP29-7B基因，并对其编码的蛋白质结构及功能进行了预测。结果显示，该蛋白具有ZIP家族高度保守结构域，也因此推断其具有锌铁转运功能，能够在体外环境重金属离子含量出现变化导致基因表达量的变化。在对TaZIP29-7B基因编码蛋白的功能预测出分析中发现，在第三和第四跨膜区间的可变区内存在高度保守氨基酸残基组氨酸，该区可能与金属离子的结合、转运有关，并且在第五跨膜区内也发现了ZIP家族所具有的高度保守的氨基酸残基组氨酸，该组氨酸残基能够与保守的第V跨膜域形成α螺旋，是膜内Zn2+的结合位点[17]，因此TaZIP29-7B基因编码蛋白属于ZIP蛋白家族。在进化树的构建过程中，对氨基酸序列进行了同源性比对分析，整个进化树分为单子叶植物和双子叶植物两部分，而TaZIP29-7B与单子叶植物中的遗传距离很近，而双子叶植物的较远，也说明TaZIP29-7B基因在长久的进化过程中是比较保守的。

A～D.相同质量浓度但不同重金属溶液 CdCl2、CuSO4、FeSO4、ZnSO4处理下TaZIP29-7B基因在根系中的表达模式 The expression patterns ofTaZIP29-7Bgene in roots treated respectively with the same concentration of CdCl2, CuSO4,ZnSO4and FeSO4；CK.未经重金属溶液处理的幼苗 Seedlings without treatment of heavy metal solution；下同 The same below

图10 根系TaZIP29-7B基因实时定量PCR分析结果
Fig.10 Expression analysis ofTaZIP29-7Bgene by qRT-PCR

图11 叶片 TaZIP29-7B 基因实时定量PCR分析结果Fig.11 Expression analysis of TaZIP29-7B gene by qRT-PCR

ZIP转运蛋白除了对植物生长所必须的营养元素如锌和铁具有转运功能外，还参与转运一些有害于植物的重金属如铅、镉、镍等。因此在除过锌、铁2种重金属离子溶液的处理下，TaZIP29-7B基因表达量对其余2种镉铜溶液的处理下依旧出现了相应的变化，并且在根部和叶片中表达量出现差异性，说明TaZIP29-7B蛋白不单单只对锌铁离子具有专一的调控作用。在处理的不同时间内，TaZIP29-7B基因表达量也有着明显的差异，说明TaZIP29-7B基因对镉离子、铜离子对小麦产生毒害的过程中起着一定的调控作用，但是在重金属离子浓度过高并且处理时间过久时，会引起叶绿素含量降低，光合作用受阻，氧化酶系统功能紊乱，核酸和蛋白质变性，可溶性糖和淀粉合成受阻[18-20]，生理生化代谢功能受到严重影响，从而致使植株生长受抑制最终死亡。

研究ZIP蛋白在植物生长过程中所起的作用，无论是在正常的生产中还是在具有重金属污染下的环境中的生产，都有一定的意义。在以往的研究中表明，AtZIP1、AtZIP5,AtZIP9,AtZIP12和AtIRT3受缺锌诱导，由此可推测，这些基因在缺锌条件下可能增强锌的吸收能力[21]，例如在野生二粒小麦中克隆的TdZIP1为缺锌诱导的锌转运体，过表达TdZIP1导致锌在细胞内的积累产生细胞毒性[22]，但是在对重金属胁迫下的功能并无研究。由于不同金属离子处于动态平衡之中，互相影响，一种元素的变化会影响到一些转运蛋白的表达变化，最终导致金属离子含量变化[13]。ZIP家族在参与多种金属离子运输过程中起着重要的作用，包括一些对植物具有毒害作用的金属离子，同样受到ZIP转运蛋白的调控。正常环境中，它对植物生长过程中促进金属离子的吸收起到良性的积极作用，而在含有毒性重金属离子的土壤环境里，其又会调节体内金属离子浓度，起到保护植物正常生长的作用。鉴于TaZIP29-7B蛋白在对重金属胁迫下所展现的作用，TaZIP29-7B基因在今后小麦育种研究中，可以视其为一个在盐胁迫方向能被重点利用的基因。如果更进一步的深入研究ZIP转运蛋白的转运机制及其在影响籽粒中金属离子的积累规律，将有助于人们达到改善现有品种以富集金属离子或降低植株对有害重金属吸收和积累的目标。