芪茵荷叶饮对糖耐量异常大鼠糖代谢及骨骼肌NF-κB信号通路的影响*

黄海超，窦昊颖，梁芳芳，王泓午

（1.天津中医药大学，天津 301617；2.天津市口腔医院，天津 300041）

糖尿病发生的一个必经阶段，称为“糖尿病前期”，包括糖耐量受损（IGT）和/或空腹血糖受损（IFG）[1]。其中，IGT患者存在明显的胰岛素抵抗及分泌障碍，是糖尿病的危险人群[2]。研究发现，糖尿病前期可增加肾脏、神经、视网膜及大血管病变的风险[3-6]。因此，对IGT患者进行有效的干预可阻止糖尿病进展，对糖尿病防治将起到重大作用。肥甘厚腻饮食是引发IGT甚至2型糖尿病（T2DM）的重要原因之一[7]，以阴虚热盛和湿热困脾为主[8-9]。前期研究已证实[10-11]，气虚和痰浊是T2DM主要的证候，气虚贯穿于糖尿病前期和T2DM病程的始终。T2DM以气阴两虚型和湿热困脾型为主，而糖尿病前期则以阴虚内热、湿热困脾为主。脾主运化、统血，输布水谷精微，喜燥恶湿，脾虚则气不足，堆积不能运化，淤积于体内助湿生痰。因此，按照益气补阴，补气益脾，清热除湿的治则可预防高脂高糖饮食引起的IGT向T2DM演变。本研究选取黄芪、茵陈蒿和荷叶三药配伍组成芪茵荷叶饮，并采用正交实验研究其能否预防IGT向T2DM演变，并从NF-κB信号通路入手，探明芪茵荷叶饮预防IGT向T2DM演变的作用机制。

1 材料

1.1 动物 4～5周龄清洁级SD雄性大鼠，体质量150～180 g，共110只。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 主要试剂与仪器 罗氏活力型血糖检测仪和血糖试纸，大鼠胰岛素ELISA试剂盒（上海宝曼生物科技有限公司）。HWY-100C恒温培养箱，Bio-Rad iMark酶标仪，EnSpire酶标仪。

1.3 药物制备 芪茵荷叶饮由黄芪、茵陈蒿和荷叶按比例配制，在天津中医药大学实验中心煎煮。每克中药加水6 mL浸泡30 min，武火煮沸后转文火煎煮30 min，过滤后收集煎液，原渣每克加水4 mL煎煮40 min，合并两次煎液，于60℃水浴浓缩成每毫升制剂相当于生药1 g，置4℃冰箱备用。给药前复温至25～30℃。

2 方法

2.1 造模方法[12]150～180 g清洁级雄性SD大鼠180只适应性喂养1周，随机抽取10只作为对照组（N）给予基础饲料喂养（碳水化合物65.42%，蛋白质占22.47%，脂肪占12.11%），其余为IGT造模组，给予45%的高脂高糖饲料（碳水化合物占35%，蛋白质占20%，脂肪占45%）。所有饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。实验期间各组大鼠自由饮水，每日投食1次。喂养12周时，IGT造模组禁食12 h后，经鼠尾采血测空腹血糖（FBG），以50%葡萄糖注射液2 g/kg体质量灌胃，2 h后再次鼠尾采血测OGTT 2 h血糖（2 h PG），以 3.9 mmol/L≤FBG＜6.1 mmol/L，7.8 mmol/L≤2 h PG＜11.1 mmol/L 并持续1周以上为造模成功，成模率60%。

2.2 分组及给药方法 将100只建模成功的大鼠随机分为模型组 1组和实验组 9组（A，B，C，D，E，F，G，H，I），设对照组 1 组，共 11 组，每组10只。按照《中国药典》给药剂量，进行大鼠与人体等效剂量换算后的剂量为中剂量，低剂量为中剂量一半，高剂量为中剂量的两倍。9组实验组用药剂量配伍按正交表L9（34）设计，见表1。水煎混合悬液灌胃，模型组和对照组生理盐水灌胃，各组灌胃体积相同，每日1次，持续12周。灌胃期间各组大鼠均普通饲料喂养。

表1 正交实验设计表Tab.1Qiyin Heye Decoction L9（34）orthogonal experimental factor level

2.3 指标检测方法

2.3.1 血清指标检测 分别在给药前、给药6周和给药12周，大鼠禁食12 h后采用葡萄糖氧化酶法测FBG、采用酶联免疫分析法空腹胰岛素（FINS）水平。计算HOMA胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=FBG×FINS/22.5。

2.3.2 骨骼肌取材 给药12周后取大鼠后肢骨骼肌样本，冻存于-80℃冰箱，待指标检测。

2.3.3 苏木精-伊红（HE）染色 将肌肉组织切片经苏木素浸染5 min左右，水洗l min，75%的盐酸乙醇分化30 s，水洗，氨水处理30 s，水洗1 min，酸化伊红乙醇液染12 min，流水快速冲洗、脱水、透明、封片固定。

2.3.4 实时荧光定量PCR检测方法 应用实时荧光反转录-多聚酶链反应（RT-PCR）检测NF-κB信号通路节点基因相关mRNA含量。采用Trizol法提取骨骼肌总RNA，反转录为cDNA，反转录条件为37℃15 min，85℃5 s。荧光定量PCR仪进行基因表达量的检测，2-ΔΔCt法对 Real-time PCR 结果进行定量分析。扩增条件为预变性95℃30 s，扩增反应为95℃5 s，60℃34 s，反复40个循环。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物，GAPDH作为内参照，GAPDH上游引物为：5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’；下游引物为：5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’；NF-κBp65 上 游 引物为：5’-GACCTGGAGCAAGCCATTAG-3’，下游引物为：5’-CACTGTCACCTGGAAGCAGA-3’；IκB-α 上游引物为：5’-TTGGTCAGGTGAAGGGAGAC-3’，下游引物为：5’-GCTTTCAGAAGTGCCTCAGC-3’。

2.4 统计学方法 采用SPSS 20.0进行统计学处理。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，正交实验采用直观分析和正交设计方差分析，重复测量资料采用重复测量方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对大鼠空腹葡萄糖的影响 给药期各组大鼠空腹葡萄糖重复测量方差分析主效应结果显示：Mauchly球形检验P=0.326，满足“球对称”。不考虑时间因素，实验各组大鼠空腹葡萄糖有统计学意义（F组间=4.269，P=0.000）。不考虑干预因素，各组大鼠空腹葡萄糖随时间变化而变化（F时间=110.670，P=0.000）。时间与组别交互效应结果显示，实验各组大鼠空腹葡萄糖随时间的变化趋势差异有统计学意义（F交互=3.240，P=0.000）。各组大鼠空腹葡萄糖变化情况：给药6周时除实验I组外其余各组血糖值均较给药前降低，其中实验E组下降最明显，与模型组相比具有统计学差异（P<0.05）。给药12周时，各实验组FBG值均反弹，其中实验B组和E组均较模型组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 芪茵荷叶饮对大鼠空腹葡萄糖的影响（）Tab.2 Effect of QYHYD on FBG among eleven rats（）

表2 芪茵荷叶饮对大鼠空腹葡萄糖的影响（）Tab.2 Effect of QYHYD on FBG among eleven rats（）

注：与模型组比较，*P<0.05。

组别对照组模型组实验A组实验B组实验C组实验D组实验E组实验F组实验G组实验H组实验I组动物数10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10时间第0周 第6周 第12周4.46±1.35* 4.81±0.73 6.00±0.42 6.11±0.72 4.82±0.46 6.17±0.41 5.76±1.22 4.36±0.45 6.44±0.32 5.68±0.59 4.94±0.35 7.05±0.99*6.08±0.78 4.86±0.55 6.41±1.02 5.85±0.26 5.23±0.48 5.73±0.58 6.11±0.74 4.23±0.54* 7.02±1.34*5.70±0.56 4.61±0.41 6.11±0.47 5.43±0.67 4.59±0.42 6.35±0.78 5.87±0.50 4.48±0.72 6.61±0.93 5.73±0.56 6.09±0.66* 6.92±0.93

3.2 芪茵荷叶饮对大鼠血清胰岛素的影响 给药期各组大鼠FINS重复测量方差分析主效应结果显示：Mauchly球形检验P=0.037，不满足“球对称”，采用校正法。不考虑时间因素，实验各组大鼠FINS有统计学意义（F组间=13.922，P=0.000）。不考虑干预因素，各组大鼠FINS随时间变化而变化（F时间=286.082，P=0.000）。时间与组别交互效应结果显示，实验各组大鼠FINS随时间的变化趋势差异有显著性（F交互=5.118，P=0.000），各组FINS随时间变化的趋势不一致。各组大鼠FINS变化：给药6周时各组FINS均较模型组降低，且有统计学差异（P<0.05）。给药12周时各组FINS水平均较给药6周时升高，但各实验组（除A和B组）较模型组降低差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

3.3 芪茵荷叶饮对大鼠HOMA-IR的影响 给药期各组大鼠HOMA-IR重复测量方差分析主效应结果显示：Mauchly球形检验P=0.335，满足“球对称”。不考虑时间因素，各组大鼠HOMA-IR有统计学意义（F组间=8.784，P=0.000）。不考虑干预因素，各组大鼠HOMA-IR随时间变化而变化（F时间=247.592，P=0.000）。时间与组别交互效应结果显示，实验各组大鼠HOMA-IR随时间的变化趋势差异有统计学意义（F交互=2.631，P=0.001），各组 HOMA-IR 随时间变化的趋势不一致。各组大鼠HOMA-IR变化情况：给药6周时除实验B组、C组及I组外，其余各组HOMA-IR均较模型组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。给药12周，实验D组、F组、G组、H组和I组HOMA-IR均较模型组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 4。

表3 芪茵荷叶饮对大鼠血清胰岛素的影响（）Tab.3 Effect of QYHYD on FBG among eleven rats（）

表3 芪茵荷叶饮对大鼠血清胰岛素的影响（）Tab.3 Effect of QYHYD on FBG among eleven rats（）

注：与模型组比较，*P<0.05。

组别对照组模型组实验A组实验B组实验C组实验D组实验E组实验F组实验G组实验H组实验I组动物数10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10时间第0周 第6周 第12周49.41±5.42 22.99±3.44* 35.69±7.51*46.50±4.62 36.34±3.00 43.77±3.02 43.87±5.93 32.24±3.01* 39.42±1.86 43.01±5.72 32.16±3.54* 39.23±5.49 42.05±2.56 32.40±2.20* 36.55±2.76*41.55±6.03 29.17±3.81* 37.75±5.84*41.20±4.05 21.75±3.12* 32.05±4.15*45.26±9.55 20.73±2.72* 33.00±4.13*44.56±3.42 19.19±4.34* 28.28±2.06*39.34±6.41 21.86±4.67* 28.17±3.24*40.94±6.80 27.80±0.75* 28.67±6.10*

表4 芪茵荷叶饮对大鼠HOMA-IR的影响（）Tab.4 Effect of QYHYD on HOMA-IR among eleven rats（）

表4 芪茵荷叶饮对大鼠HOMA-IR的影响（）Tab.4 Effect of QYHYD on HOMA-IR among eleven rats（）

注：与模型组比较，*P<0.05。

组别对照组模型组实验A组实验B组实验C组实验D组实验E组实验F组实验G组实验H组实验I组动物数10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10时间第0周 第6周 第12周9.73±2.91* 4.90±1.02* 9.57±2.35*12.56±1.37 7.83±1.29 12.00±1.14 11.00±1.21 6.27±0.88* 11.29±0.87 10.75±0.96 7.06±0.98 12.28±2.27 11.37±1.73 6.96±0.40 10.50±2.41 10.85±1.96 6.75±0.96* 9.63±1.97*11.17±1.65 4.08±0.92* 10.09±2.64 11.55±2.86 4.17±0.50* 8.99±1.53*10.65±0.60 3.95±1.22* 7.93±0.77*10.26±1.88 4.37±1.32* 8.25±1.30*10.38±1.84 7.43±0.92 8.82±2.08*

3.4 芪茵荷叶饮正交实验结果 给药12周时正交结果极差分析和方差分析显示，对FBG影响的主次因素为茵陈蒿＞黄芪＞荷叶，最佳配伍方案为中剂量黄芪+高剂量茵陈蒿+高剂量荷叶；对FINS影响的主次因素为黄芪＞荷叶＞茵陈蒿，最佳配伍方案为高剂量黄芪+高剂量茵陈蒿+中剂量荷叶；对HOMAIR影响的主次因素为茵陈蒿＞黄芪＞荷叶，最佳配伍方案为低剂量黄芪+低剂量茵陈蒿+低剂量荷叶。方差结果分析显示，不同剂量的茵陈蒿对FBG影响存在统计学差异，不同剂量黄芪对FINS和HOMA-IR存在统计学差异。见表5、表6。

表5 第12周正交实验结果极差分析Tab.5 Range analysis of orthogonal experimental results at week 12

表6 第12周正交实验结果方差分析（）Tab.6 ANOVA of orthogonal experimental results at week 12（）

表6 第12周正交实验结果方差分析（）Tab.6 ANOVA of orthogonal experimental results at week 12（）

注：*P<0.05。

药物 剂量 FBG FINS HOMA-IR images/BZ_28_1041_804_1099_841.png F images/BZ_28_1041_804_1099_841.png F images/BZ_28_1041_804_1099_841.png F黄芪 低 6.63±0.91 1.03 38.40±4.03 27.61*11.359±2.159 12.73*中 6.26±1.05 34.42±5.44 9.570±2.145高 6.65±0.91 28.38±4.17 8.370±1.531茵陈蒿 低 6.14±0.69 3.21*35.60±6.14 1.85 9.695±1.914 0.87中 6.88±1.12 32.92±6.43 10.120±2.736高 6.50±0.91 32.56±5.64 9.408±2.181荷叶 低 6.40±0.67 0.35 33.29±5.74 2.35 9.451±1.828 1.05中 6.55±1.03 35.04±7.43 10.154±2.540高 6.61±1.17 32.49±4.74 9.586±2.490

3.5 骨骼肌组织病理学变化 给药12周末，大鼠肌肉组织HE染色结果显示：对照组大鼠骨骼肌形态完整、肌纤维排列整齐；模型组及9组实验组大鼠骨骼肌肌纤维排列紊乱、均有水肿，模型组水肿较为明显、可见炎症细胞浸润，见图1。

3.6 芪茵荷叶饮对大鼠骨骼肌 IκB-α及NF-κBp65mRNA的影响 给药期间各实验组大鼠骨骼肌IκB-α表达经方差分析具有统计学差异（F=51.819，P<0.01），其中实验H组IκB-α明显高于模型组，差异有统计学意义。各组大鼠NF-κBp65mRNA方差分析结果显示具有统计学差异（F=51.819，P<0.01）。与实验 M 组相比，A、C、G 3 组 NF-κBp65 下降，其中G组差异有统计学意义（P<0.05），见表7。

图1 大鼠骨骼肌病理组织学变化Fig.1 Histopathological changes of skeletal muscle among groups of rats

表7 芪茵荷叶饮对大鼠IκB-α和NF-κBp65 mRNA表达的影响（）Tab.7 Effect of QYHYY on the expression of IκB-α and NF-κBp65 mRNA among eleven rats（）

表7 芪茵荷叶饮对大鼠IκB-α和NF-κBp65 mRNA表达的影响（）Tab.7 Effect of QYHYY on the expression of IκB-α and NF-κBp65 mRNA among eleven rats（）

注：与模型组比较，*P<0.01。

组别对照组模型组实验A组实验B组实验C组实验D组实验E组实验F组实验G组实验H组实验I组F值动物数10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 IκB-α NF-κBp65 3.39±4.42 2.12±2.73*0.29±0.45 0.14±0.29 0.14±0.08 0.04±0.03 0.72±2.07 0.81±2.31 0.26±0.24 0.09±0.12 0.77±0.90 0.21±0.29 0.86±1.22 0.36±0.56 4.97±7.18 1.83±2.62 0.02±0.02* 0.01±0.01*5.77±4.79* 2.70±3.45 5.76±6.91 1.74±2.19 51.819* 54.215*

4 讨论

IGT是消渴症的前驱状态，中医称之为脾瘅。《圣济总录·消渴》中记有：“消瘅者，膏粱之疾也，肥美之过，积为脾瘅，瘅病既成。”饮食失节、劳逸失调，则脾运不健，水谷运化失司，痰湿凝聚，燥热内生。因此，按照补气益脾，清热除湿的治疗原则对高脂高糖饮食引起的IGT患者进行干预，可有效预防IGT向T2DM演变。据此自拟芪茵荷叶饮，本方中黄芪性味甘温、归肺、脾经，具有益气补虚功效，现代药理学研究也表明黄芪具有降血糖、降血脂之功效[13]，是中医临床常用的降糖组方用药。茵陈蒿，性微寒味苦，归脾、胃、肝和胆经，具有清利湿热之效，研究表明茵陈蒿中的有效化合物β-谷甾醇、槲皮素等可通过多条信号通路作用于靶标蛋白发挥其抗炎、降脂作用[14-15]。荷叶，性微温平味辛，归肝、脾经，清热除湿、利水通便，适用痰湿体质，荷叶具有降脂抗氧化之功效[16]。

本研究通过高糖高脂饮食诱导的方法，成功构建了IGT大鼠模型，造模成功的大鼠出现了血糖升高、糖耐量受损等症状。给予芪茵荷叶饮干预6周后，除实验I组外其余各干预组FPG均有所下降，其中实验 E 组具有统计学差异（P＜0．05）；干预12周时FPG较干预6周时回升，除实验D组外均超过干预前水平，D组为唯一低于干预前水平组别，说明芪茵荷叶饮对IGT大鼠FPG具有调节作用，可能为高剂量茵陈蒿发挥主要作用，但调节血糖效果不稳定，仍需延长观察时间以确定疗效。FINS水平与胰岛β细胞功能、血糖的稳定以及T2DM发生发展密切相关，研究表明IGT的发生与FINS浓度的进一步增加有关[17]。本研究干预6周时FINS下降，12周时略有回升但均未达到给药前水平，说明芪茵荷叶饮可通过调节FINS改善β胰岛细胞功能。HOMA-IR可以反映胰岛素抵抗状态和胰岛素敏感性，指数随胰岛素抵抗程度增加而升高。本研究中模型组大鼠HOMA-IR上升，出现IR状态，而经芪茵荷叶饮干预6周和12周后，部分实验组HOMA-IR较模型组下降，且除A和B组外均低于给药前水平，说明芪茵荷叶饮在保护胰岛β细胞、改善胰岛功能、减轻胰岛素抵抗方面具有一定功效。

正交实验结果提示，仅不同剂量茵陈蒿对FBG影响存在统计学差异，茵陈蒿取高剂量效果最佳；仅不同剂量黄芪对FINS和HOMA-IR存在统计学差异，黄芪取低剂量效果最佳。荷叶对3项指标的影响均不显著，从经济学角度可取低剂量。综合分析，黄芪为君、茵陈蒿为臣、荷叶为辅，低剂量黄芪、高剂量茵陈蒿配伍低剂量荷叶为最优方案。

本研究病理切片显示模型组大鼠骨骼肌组织水肿、有炎症细胞浸润，说明IGT大鼠骨骼肌存在炎性反应。研究表明，糖尿病前期就可能已经存在炎性反应[18]。骨骼肌是机体慢性炎症发生、发展的重要组织，骨骼肌慢性炎症是T2DM发病的早期分子事件[19]。胰岛素抵抗是IGT的主要表现，长期高脂饮食引起体重增加，可使体内炎性因子分泌增加、炎症信号通路激活，从而诱发胰岛素抵抗，导致骨骼肌稳态失调、肌组织结构受损[20]。

NF-κB是重要转录激活因子，在静息状态下IκBα与NF-κB杂二聚体以结合形式位于细胞质中，抑制NF-κB活化。当机体受到某些外界刺激时，IκBα 磷酸化从 NF-κB 二聚体解离，NF-κB 活化并进入细胞核，调控细胞功能[21]。相关研究表明NF-κB作为机体重要的炎症转录因子，与葡萄糖摄取紊乱及胰岛素抵抗密切相关，其表达水平在糖尿病前期即开始升高[22]。本研究通过NF-κBp65和IκBα基因表达水平来反映NF-κB信号通路的激活状况。本研究中实验G组较M组NF-κBp65蛋白表达水平下降显著，G组为低剂量黄芪+高剂量茵陈蒿+低剂量荷叶，说明此配伍可能会抑制NF-κB信号通路进而减轻炎症反应，与正交实验结果一致。

5 结论

黄芪、茵陈蒿和荷叶三药存在交互作用，按影响主次顺序为黄芪＞茵陈蒿＞荷叶，最佳配伍为半量黄芪、2倍量茵陈蒿和半量荷叶。此配伍组方可改善IGT大鼠胰岛素抵抗，通过抑制NF-κB信号通路、减轻炎症反应，从而控制或延缓IGT向T2DM演变。