激活TLR5和 NLRC4通路的重组鞭毛素蛋白对4T1乳腺癌细胞及荷瘤小鼠的影响①

张 景 李荣辉 罗 力 卓召振 袁 军 李 伟

(贵州医科大学免疫学教研室，贵阳550004)

据世界卫生组织的数据显示，女性肿瘤中发病率最高的是乳腺癌，而乳腺癌的标化死亡率(Standard mortality ratio，SMR)在所有癌症中位列第二，紧随肺癌之后[1]。乳腺癌对人类产生的威胁不容忽视，人类对于乳腺癌的研究还有待深入。Toll 样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一类重要的模式识别受体，表达于多种正常细胞，通过对病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecula patterns,PAMPs)等的识别启动细胞内信号转导，通过分泌细胞因子等物质从而产生生物学效应，对固有免疫应答和适应性免疫应答均有调节作用[2-5]。其中TLR5 表达于一些固有免疫细胞，鞭毛素蛋白(Flagellin)作为其唯一的配体，能够被 TLR5 特异性识别，识别后启动 TLR5 和 NLRC4 信号通路[2]。有文献报道称，TLR5 在人乳腺癌中高表达，并且其通路在人乳腺癌细胞中起着重要作用。这种作用主要表现在，激活乳腺癌细胞上的 TLR5 通路后能抑制肿瘤细胞的增殖，从而推断出以鞭毛素蛋白激活 TLR5通路后，促进促炎症细胞因子分泌而产生的潜在抗肿瘤效应[6]。另一些研究表明，鞭毛素蛋白对一部分肿瘤细胞，如胃癌细胞，不仅没有抑制作用，反而有促进肿瘤细胞增殖的作用[7]。但也有研究表明，在小鼠乳腺癌模型中，不同时间段注射鞭毛素蛋白治疗肿瘤会起到完全相反的作用，在肿瘤早期使用鞭毛素蛋白会促进肿瘤增长，而肿瘤移植后8～10 d开始注射则可显著抑制肿瘤，另外，CpG 寡核苷酸能激活 TLR9通路产生抗肿瘤效果，而鞭毛素蛋白与其联用后，能显著增强 CpG 寡核苷酸对肿瘤生长的抑制效果[2]。

本课题组在之前的实验中已证实鞭毛素蛋白对多种乳腺癌细胞具有抑制作用，不激活TLR5或NLRC4通路的鞭毛素蛋白也可以抑制乳腺癌细胞增殖，对于乳腺癌4T1细胞尚无相关报道，本研究将探索激活TLR5和NLRC4通路对乳腺癌4T1细胞增殖及荷瘤小鼠肿瘤生长的影响，为我们进一步了解鞭毛素蛋白在肿瘤免疫中的作用，以及利用鞭毛素蛋白进行抗肿瘤免疫打下实验基础。

1 材料与方法

1.1材料 4T1小鼠乳腺癌细胞(北京北纳创联生物技术研究院)，DMEM培养基(Gibco)，RPMI1640培养基(Hyclone)，无菌PBS(博士德公司)，氨苄青霉素和链霉素(北京索莱宝公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，培养瓶(美国康宁)，EIPTG，EBradford蛋白定量试剂盒，EMTT细胞增殖检测试剂盒DMSO(北京索莱宝公司)，酶标仪(Thermo)，内毒素检测试剂盒(厦门鲎试剂有限公司)，人IL-8细胞因子检测试剂盒，小鼠IL-1β检测试剂盒(武汉博士德公司)，LDH释放检测试剂盒(碧云天)，BALB/c小鼠(重庆腾鑫动物有限公司)，表达菌株FliC，EFliC-L3A、FliCΔ90-97 和 FliCΔ90-97:L3A(中国科学院武汉病毒所鄢慧民研究员惠赠)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 4T1、Caco-2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，每隔3～5 d进行传代培养，待细胞进入对数生长期时，收获细胞备用。

1.2.2重组鞭毛素蛋白活性检测 利用人肠上皮细胞系Caco-2细胞检测TLR5通路激活，将培养好的Caco-2细胞传代接种至24孔板，约2×105个/孔，10%FBS高糖DMEM，37℃，5%CO2培养5 d。细胞极化好后换用无血清DMEM培养基进行培养，待细胞饥饿8～12 h后，吸弃培养基，用无血清培养基将纯化后鞭毛素蛋白稀释成10 μg/ml，每组3个重复，刺激6 h发收集上清，检测IL-8的浓度(详细步骤参见人IL-8细胞因子检测试剂盒说明书)。

利用小鼠腹腔原代巨噬细胞检测NLRC4通路的激活：小鼠摘眼球放血，脱颈椎处死，75%酒精消毒腹部，放入超净台中，从胸骨剑突处V型剪开小鼠皮毛，向下撕开鼠皮至盆骨处，暴露整个腹壁，腹腔注射10 ml RPMI1640培养基和适量空气，双手紧握小鼠颈部和尾部，剧烈振荡20次，使腹腔巨噬细胞充分洗脱下来。在剑突下方剪一小口，用巴氏吸管插入腹腔，吸取灌洗液，注意不要有血液污染。灌洗液离心后弃上清后加1 ml 10%FBS的RPMI1640，混匀后细胞计数。调整细胞数量，每孔约5×105个细胞铺于96孔板。过夜培养后，用 RPMI1640 洗去未贴壁的非巨噬细胞，加入50 μl RPMI1640培养基稀释后的LPS(50 ng/ml) 预处理3 h，轻轻用PBS清洗一遍。加入200 μl 3%FBS的RPMI1640稀释后的鞭毛素蛋白(10 μg/ml) 刺激20 h，以上均严格无菌操作，实验结束前1 h阳性对照孔加入1%体积的LDH，收集上清检测IL-1β和LDH(详细步骤参见人IL-1β、LDH检测试剂盒说明书)。

1.2.3MTT检测细胞增殖 配制鞭毛素蛋白，使其浓度为2 μg/ml，充分涡旋混匀，注意无菌操作,然后相应鞭毛素蛋白孔加入100 μl,充分吹散细胞，混匀，牛鲍氏计数板计数，调整细胞数至4×104个/ml，每孔加100 μl,即每孔细胞数为4 000个,37℃ 5%CO2培养70 h。然后每孔加入10 μl的MTT 试剂,继续培养 4 h。800 r/min离心5 min,轻轻甩掉上清，加入150 μl DMSO,37℃10 min或室温摇床10 min 使甲臜充分溶解,测定OD490 nm值，根据公式计算抑制率。抑制率(%)=(空白组OD值-处理组OD值)/空白组OD值×100%。

1.2.4鞭毛素蛋白对荷瘤小鼠的影响 雌性BALB/c 6～8周龄小鼠先观察3～5 d确认小鼠无异常后开始正式实验，将30只小鼠随机分为6组，分别是Control组、生理盐水(Normal Saline，NS)组、FliC组、FliCΔ90-97组、FliCΔL3A组和FliCΔ90-97：L3A组，Control组小鼠不作任何处理，其余小鼠乳腺部位皮下注射乳腺癌4T1细胞3.5×105个/只，建立乳腺癌肿瘤模型，造模第7天起分别腹腔注射鞭毛素蛋白或生理盐水，隔天一次，共10次，并记录小鼠肿瘤大小、体重变化。其中测量肿瘤大小的方法是用游标卡尺分别测量长径(L)和短径(D)，并用公式V=L×D2/2 计算肿瘤体积大小。

1.3统计学处理 实验结果用GraphPad Prism 5软件进行统计处理。所得结果的比较采用Oneway ANOVA和t检验共同分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1重组鞭毛素蛋白的活性检测 四种重组鞭毛素蛋白刺激Caco-2细胞系，结果显示能够激活TLR5通路的全长FliC组和FliC-L3A组IL-8分泌分别为(540.62±46.05)pg/ml和(357.48±32.32) pg/ml与对照组(32.68±2.49)pg/ml相比有显著差异(P<0.01)，而不能激活TLR5通路的FliCΔ90-97和FliCΔ90-97:L3A组IL-8分泌与对照组相比无统计学差异(P>0.05)(图1A)。

四种重组鞭毛素蛋白刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞，鞭毛素蛋白激活NLRC4炎症小体后，不仅可以导致细胞炎症因子IL-1β和IL-8的分泌，同时还可以诱导细胞的凋亡，这种凋亡是依赖Caspase-1蛋白的，使胞质中的LDH释放出来。结果显示，全长FliC和FliCΔ90-97分泌IL-1β分别为(1 656.26±160.71)pg/ml、(1 039.18±151.5)pg/ml，与对照组(62.91±19.17)pg/ml相比差异有统计学意义(P<0.01)。相反FliC-L3A组和FliCΔ90-97:L3A组与对照组相比IL-1β释放无差异(P>0.05)(图1B、C)。

2.2MTT法检测不同浓度重组鞭毛素蛋白对4T1乳腺癌细胞的抑制作用 由图2可知，四种鞭毛素蛋白在1 μg/ml的浓度下，两条通路都不激活的FliCΔ90-97对4T1细胞的抑制率达到38.84%,高于全长的FliC(35.53%)、FliC-L3A(36.33%)和FliCΔ90-97：L3A(37.64%)，说明鞭毛素蛋白抑制4T1细胞增殖可能通过其他途径。经Graphpad 软件统计学分析， 四种鞭毛素蛋白对4T1细胞的抑制作用与Control组相比差异均有显著统计学意义(P<0.05)，顺铂作为阳性对照(抑制率为44.87%)。

图1 四种重组鞭毛素蛋白激活TLR5和NLRC4通路的活性检测Fig.1 Bioactivity activating TLR5 and NLRC4 pathways of four recombinant flagellinsNote: **.P<0.01.

图2 重组鞭毛素蛋白抑制4T1细胞的增殖Fig.2 Recombinant flagellins inhibit proliferation of 4T1Note: **.P<0.01.

图3 小鼠体重变化趋势 Fig.3 Variation tendency of mice weight

图4 小鼠肿瘤体积变化Fig.4 Variation tendency of tumor volumeNote: *.P<0.05.

2.3各组小鼠体重变化及总体身体情况 如图3所示，用天平测量小鼠体重并监测体重变化。注射鞭毛素蛋白(图3中第7天)前，各组小鼠体重呈上升趋势，而开始免疫后，各组体重均有不同程度的下降，后续有一定波动，最终，FliC组的平均体重最轻约为17.34 g，FliCΔ90-97：L3A组18.08 g,FliCΔ90-97组18.47 g,FliC-L3A组19.13 g，NS组18.78 g,Control组体重最重为19.75 g。从生活状态观察，Control组小鼠饮食及精神状态正常，鞭毛素蛋白组稍差，NS组自发活动减少，静卧不动，背毛粗糙。直至实验第28天，为小鼠处死时间，统一处死小鼠后得到各组最终生存率。 Control组为未接种肿瘤的空白对照组，其最终生存率为 100%,实验过程中没有小鼠死亡，其次是鞭毛素蛋白组,其最终生存率为60%，NS组最终生存率为 20%(数据没有展示)。

2.4各组小鼠肿瘤生长情况 如图4所示，与NS组相比,19 d后，FliC组、FliCΔ90-97:L3A组和FliC-L3A组对肿瘤生长均有显著抑制作用(P<0.05)。但是，FliCΔ90-97组却没有明显的抑制肿瘤生长的作用(P>0.05)。FliC-L3A、 FliCΔ90-97:L3A和FliC三组对肿瘤的抑制没有显著差异(P>0.05)。

3 讨论

鞭毛素蛋白的相关研究主要基于其佐剂功能和抗肿瘤作用，近年来可以被胞内NLRC4识别的分子机制被逐渐阐明。鞭毛素蛋白可以通过激活乳腺癌细胞上的TLR5抑制肿瘤细胞的增殖[8]，NLRC4炎症小体在结肠癌的发生发展中起重要作用[9]，另外鞭毛素蛋白能够增强肿瘤的放疗敏感性[10]，虽然鞭毛素蛋白对某些肿瘤细胞有直接的抑制作用，如乳腺癌、肺癌等[11,12]，但是肿瘤细胞对于鞭毛素蛋白的反应性不尽相同，这不仅仅和TLR5的亚细胞定位有关，体内实验表明，鞭毛素蛋白和肿瘤细胞同时注射产生的效应与鞭毛素蛋白在肿瘤细胞之后注射产生的效应相反，可能与激活TLR5和NLRC4导致的细胞因子分泌情况的差异，诱导出不一样的免疫应答有关[13,14]。提示鞭毛素蛋白可以通过激活TLR5和(或)NLRC4两条信号通路发挥抗肿瘤的作用。我们实验室前期的工作发现鞭毛素蛋白能够激活人乳腺癌细胞系MCF-7的TLR5通路，并分泌IL-8等细胞因子[13]。

4T1细胞系是构建小鼠乳腺癌动物模型常用的细胞系。通过体外研究重组鞭毛素蛋白对4T1细胞系的影响，可以为我们利用小鼠乳腺癌模型研究TLR5和NLRC4两条通路在肿瘤免疫中的影响打下基础。本实验表明，重组鞭毛素蛋白体外对乳腺癌4T1细胞有抑制作用，我们课题组前期也发现重组鞭毛素蛋白对乳腺癌细胞系MCF-7细胞和MDA-231细胞均有显著的抑制作用[15]。这说明重组鞭毛素蛋白对人乳腺癌细胞系和小鼠乳腺癌细胞系均有显著的抑制作用，而且这种抑制作用与TLR5和NLRC4通路的激活无显著相关性。

动物实验中各鞭毛素蛋白对乳腺癌的抑制作用与体外实验结果并不完全一致，由于体外实验结果显示各组鞭毛素蛋白抑制乳腺癌细胞系4T1的能力无显著差异，所以动物实验结果显示各组间的差异可能与体内TLR5和NLRC4通路的激活密切相关。当只激活NLRC4通路，鞭毛素蛋白不能抑制肿瘤的增殖。说明体内NLRC4通路的激活减弱了鞭毛素蛋白抑制肿瘤增殖的能力。只激活TLR5通路和同时激活TLR5和NLRC4通路都不能显著增强FliCΔ90-97:L3A蛋白抑制肿瘤增殖的能力，说明体内TLR5通路的激活并不能够增强机体的抗肿瘤免疫细胞的杀伤肿瘤的能力。先前我们认为重组鞭毛素蛋白对肿瘤的抑制作用有直接作用和间接作用之分，可以通过对肿瘤细胞的直接作用影响肿瘤细胞的生长，也可通过对免疫系统的间接作用促进免疫系统对肿瘤的杀伤，从而抑制肿瘤生长。但是本实验结果显示，鞭毛素蛋白激活荷瘤小鼠体内的TLR5和NLRC4两条通路对乳腺癌细胞增殖有不同的影响。FliCΔ90-97组肿瘤体积与NS组相当，说明在体内单独激活NLRC4通路并不能有效抑制乳腺癌肿瘤的生长，其原因还需进一步研究。因此，我们在利用鞭毛素蛋白抗肿瘤的同时，应尽量避免其激活体内的NLRC4通路。鞭毛素蛋白作用后小鼠的存活率与NS组相比明显增高，说明鞭毛素蛋白能提高荷瘤小鼠的存活率(数据未展示)。本实验结果为我们进一步了解鞭毛素蛋白在肿瘤免疫中的作用，以及利用鞭毛素蛋白进行抗肿瘤免疫打下实验基础。