近红外荧光探针检测碱性磷酸酶的研究进展

齐亚军，姜良勇，王洪香，殷俪宁，高荣升*

(1.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007； 2.德州市中医院，山东 德州 253000)

恶性肿瘤已成为威胁人类生命健康的主要疾病之一[1]，在我国这种情况更为严重，能否尽早发现肿瘤和介入治疗对患者生存期的延长起到了重要作用[2]。临床研究表明恶性肿瘤在发病初期临床症状并不明显，易被患者忽视，当肿瘤发展至中晚期时，发生扩散或产生明显包块临床症状才凸显出来，此时再进行手术治疗往往伴随着高转移率和高复发率，而该阶段肿瘤已对传统的放射疗法和化学药物疗法不再敏感，最终给患者带来极大的痛苦。早期恶性肿瘤可以通过外科手术进行切除，这也是早期患癌病人的最有效和首选的治疗方案。然而，实体肿瘤的切除往往需要富有经验的临床医生负责完成，其往往需要肿瘤的体积达到一定大或出现明显转移灶才能确诊。因此，现代医学急需一种能够帮助临床医生快速诊断肿瘤存在和明确肿瘤大小及边界的检测手段，这也是广大科研工作者急需突破的诊断技术瓶颈。

近年来研究发现正常细胞向恶性细胞的转化常导致酶合成异常。由于酶促变化发生在形态变化之前，因此癌前病变中酶的血清活性的研究受到高度重视。碱性磷酸酶(ALP)是一种水解酶，可催化蛋白质和非蛋白质底物的水解和转磷酸化，由一组在哺乳动物组织中广泛存在的同工酶组成[3]。越来越多的证据表明血液中ALP水平异常升高与癌症，心脏病，骨骼疾病和肝脏疾病等各种疾病有关[4-5]。因此，开发一种操作简单、迅速高效、灵敏度高、特异性好的ALP检测方法对人类疾病的临床诊断具有重要的意义[6]。

1 ALP检测方法

1.1 电化学检测法

依据电能与化学能之间相互转变的原理，ALP能够水解多种多样的磷酸单酯为可检测的酚衍生物，使用非电性基底进行电化学，在ALP作用后去磷酸化产生电活性产物。如对氨基苯基磷酸酯(PAPP)已被广泛用作基板，碱性磷酸酶脱磷产生对氨基苯酚(PAP)，可以在低电位下测量电流[7]，从而得知碱性磷酸酶的含量。电化学检测法具有灵敏度高、周期短、成本低、和广泛的基体物种性等优点。但其稳定性受限，易受背景信号的影响，可重复性较低。

1.2 化学发光法

碱性磷酸酶水解AMPPD(1,2-二氧环己烷衍生物)生成可以被强光分解的苯氧化物中间态，通过检测其被光分解后的活度来确定酶活性大小。该方法操作简便、灵敏度较高，但该底物药品价格昂贵[8]。

1.3 纳米探针检测法

将金纳米粒子与过载的羟基磷灰石结合，再与用于医疗诊断的成像染料如吲哚菁绿偶联构成智能纳米探针，碱性磷酸酶水解的磷酸基团利用荧光共振能量转移效应被检测出，其含量通过荧光强弱来判断。该方法通过非侵入的方式检测体内或体外的ALP含量，具有自发荧光干扰小、稳定性好、操作简便等优点。但其特异性较差且荧光染料的不同限制了其灵敏度[9]。

1.4 荧光探针检测法

磷酸酯为碱性磷酸酶的作用底物，设计含有具有聚集诱导发射特性的荧光素与磷酸酯的荧光探针，利用分子内电荷转移的原理，达到磷酸化与去磷酸化的即时转换，可观测到磷酸化时为低荧光状态，去磷酸化时表现为强荧光状态，根据荧光的强弱以达到检测ALP的目的[10]。

Park Sung Young 教授课题组在2017年报道了一种能够根据细胞内碱性磷酸酶活性用于肿瘤的特异性荧光传感的荧光淬灭型探针C-FNP[11]。当碱性磷酸酶作用于该探针时，磷酸根从4-硝基苯磷酸盐上解离，成为 4- 硝基苯酚，根据光诱导电子转移原理电子被转移到 4-硝基苯酚，荧光发生猝灭，以此实现活体内的肿瘤成像。其检测原理如图1所示。

Fig.1 The principle of C-FNP detecting ALP

2017 年，谭蔚泓教授课题组设计合成了一种完全不溶于水且固态时发射强荧光的基于激发态分子内质子转移 ( Excited State Intramolecular Proton Transfer,ESIPT)的新型固态荧光团HTPQ[12]。作者进一步将 HTPQ 设计为碱性磷酸酶的响应荧光探针 HTPQA。HTPQA 能够在活体细胞中原位检测内源性的 ALP，达到肿瘤组织可视化的目的。其检测原理如图2所示。

Fig.2 The principle of HTPQA detection of ALP

商化染料ELF-97是可溶性的磷酸酶底物，其ALP作用位点磷酸基团移除时可由只在蓝色范围有弱荧光的状态生成强烈荧光的黄绿色沉淀，斯托克位移超过了100nm。其检测原理如图3所示。

Fig.3 The principle of ELF-97 detecting ALP

2018年，张志琪教授课题组将荧光硅纳米粒子(SINPs)作为荧光探针，建立了一种简单灵敏 、选择性高的碱性磷酸酶活性检测方法[13]。碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸二钠( Disodium Nitrophenyl Phosphate,PNPP)水解产生吸收光谱与荧光硅纳米粒子的激发光谱有很好的重叠的对硝基酚(P-Nitrophenol,PNP)，从而猝灭SINPs的荧光。通过监测SINPs的荧光猝灭率与对硝基酚含量之间的关系实现对ALP活性的测定。其检测原理如图4所示。

Fig.4 The principles of SINPs for detecting ALP

荧光探针检测法为非入侵性、传感机制简单，操作方法简便，但受到荧光染料的影响，导致其特异性差、不能准确识别，毒性以及存在背景干扰等。传统的荧光染料存在灵敏度低、特异性差、复杂的传感机制以及短的发射和激发波长等弊端，相比传统的荧光染料，近红外荧光染料有更长的激发和发射波长、极好的时空分辨率、更深的组织穿透力以及较低的自发荧光的背景干扰，可以更加完善的检测体内碱性磷酸酶的活性。

2 近红外荧光探针检测ALP的研究进展

NIR荧光探针改变了传统荧光染料的低灵敏度及低特异性，对生物基质的破坏作用小于紫外和可见荧光团的影响。目前，适宜合成检测碱性磷酸酶的NIR荧光探针主要有：

2.1 香豆素类近红外荧光探针

常规的香豆素类荧光探针因其发射波长较短，主要在400～520nm区域，组织穿透性弱、易受到背景荧光干扰的特性限制了其在活体成像中的应用，但因其具有优异的光稳定性、较高的荧光量子产率、易于修饰的特性，近年来香豆素类荧光染料的结构修饰成为研究热点[14]。如将半花菁结构引入到香豆素、将香豆素并入BODIPY中，合成了一系列新型NIR荧光染料。改良修饰后的香豆素荧光探针在保留原有的Stokes 位移大、光稳定性好等优点的基础上，使香豆素的吸收和发射光谱显著向 NIR 区域移动，这一优化使其更加广泛的应用于生物医学领域，如检测各种离子、荧光标记蛋白质分子等，有望成为检测ALP的新型近红外荧光探针。2018年江洪教授课题组报道了一类检测ALP的香豆素荧光探针[15]，其原理为碱性磷酸酶水解抗坏血酸磷酸酯钠产生可将二价铜离子还原成为一价亚铜离子的游离态抗坏血酸钠，通过催化反应和叠氮反应使弱荧光强度的4-甲基-7-乙炔基香豆素生成强荧光强度的三氮唑香豆素，通过荧光增强的程度检测ALP的活性。其检测原理如图5所示。

Fig.5 The principle of detection of ALP by coumarin probe

2.2 花菁染料荧光探针

花菁染料荧光探针具有较高的吸光系数，是已知的最早可发射红外和近红外波长的染料。花菁染料具有吸光系数大、荧光量子产率高、最大吸收和发射波长均在近红外区等优异的物理化学性质，这使得花菁染料作为荧光探针具有较高的检测灵敏度、对组织损伤较小、不受生物组织干扰等优点。因此，花菁染料被广泛应用于生物医疗诊断[16]。2019年，吉林大学化学学院课题组设计了一种新型半花菁荧光染料MTR用于检测碱性磷酸酶的活性[17]。在ALP存在下，该荧光团在723nm处表达56倍的荧光增强。与经典的花菁染料相比，它具有更长的发射波长，更大的斯托克斯位移和更高的量子产率，该探针已成功实现了在不同细胞中对碱性磷酸酶的荧光成像检测。其检测原理如图6所示。黄鹏教授等人在2019年将近红外荧光(NIRF)成像与光声(PA)成像相结合用于ALP的检测[18]。该探针由近红外荧光团LET-CyOH和磷酸盐组成，可在730nm处显示出23倍的NIRF增强，激活时在710nm处显示出27倍的PA增强。该成果利用光声成像克服了近红外荧光成像的低空间分辨率和穿透深度限制的弊端，对ALP具有较高的灵敏度，实现了体内对碱性磷酸酶高空间分辨率的检测，其检测原理如图7所示。2017年，Tan Y[19]等人使用花菁DHX作为近红外荧光团，磷酸基团作为反应位点，该探针有着较高的吸光系数，较强的灵敏度以及较低的细胞毒性，在细胞和活体水平实现了对碱性磷酸酶的检测。其检测原理如图8所示。同年，李春艳课题组设计合成了一种基于半花菁的NIR荧光探针CyP用于检测碱性磷酸酶[20]。碱性磷酸酶能够催化CyP中磷酸基的断裂，诱导CyP 向 CyOH 转化，在738 nm处发射荧光。该荧光探针的最大发射峰位于近红外区域，组织穿透性强，已应用于活体细胞、组织和小鼠内源性ALP的检测和成像，该探针具有较高的灵敏度及较低的ALP检测线。其检测原理如图9所示。

Fig.6 The principle of MTR detection of ALP

Fig.7 The principle of LET-CYOH detection of ALP

Fig.8 The principle of DHXP detecting ALP

Fig.9 The principle of Cy-OH detection of ALP

2.3 BODIPA类荧光探针

BODIPA是一种氟硼二吡咯类化合物，具有良好的物理化学性质，如对酸碱不敏感、化学性质稳定、荧光量子产率较高(在水中通常可达到 100%)、荧光激发和发射峰宽较窄、吸收和发射峰波长通常可达到可见光区甚至近红外区、在很多有机溶剂中溶解度都较高等，可以广泛应用于生物检测[21]。Lin[22]等人于2016年报道了以BODIPY衍生物作为荧光基团、可以被ALP水解形成BODIPY 腺苷染料和磷酸根离子的三磷酸腺苷作为识别位点的荧光探针，通过BODIPY腺苷染料的荧光强度检测ALP的活性。其检测原理如图10所示。

Fig.10 The principle of detection of ALP by BODIPY probes

2.4 荧光素类荧光探针

荧光素类探针因具有较高的荧光量子产率、较强的荧光强度、良好的水溶性、其衍生物的最大发射波长可以达到红外甚至近红外区域的特点近年来受到广大科研人员的追捧。但其也存在一定的缺陷，如光稳定性差、该类探针的合成收率较低，且提纯困难。尽管如此，由于其具有较大的stokes位移、细胞渗透性强、线粒体靶向定位等优势，使得该类探针被广泛用于化学、生化、生物以及医学领域[23-24]。以荧光素作为发光基团的荧光素二磷酸酯(3,6-fluorescein diphosphate,FDP)，作为ALP的作用底物具有较强的灵敏度。因其较高的荧光量子产率、较低的检测线、良好的光稳定性使得 FDP 成为一个优越的碱性磷酸酶底物，在生物医学领域发挥着重要的作用。其检测原理如图11所示。

Fig.11 The principle of FDP detection of ALP

3 作用机制

近红外荧光诊断试剂由荧光团和磷酸酶反应位点组成，采用OFF-ON型策略设计，基本原理为分子内电荷转移。诊断试剂在OFF状态，此时荧光基团处于缺电子状态，整个体系为不发荧光状态。当该体系在体内弱碱性环境下通过碱性磷酸酶的酶促去磷酸化后，磷酸酶去除荧光基团上的磷酸部分，导致分子内电荷转移效应的恢复和荧光的"开启"成为ON的状态，此时荧光基团处于给电子状态，该试剂可以发射激发光处在600nm以上的近红外红光，并可以被荧光光谱仪检测到，以达到体内碱性磷酸酶活性可视化的目的。

4 展望

本文综述了近年来几种常见的荧光探针及近红外荧光探针在碱性磷酸酶领域的应用，这些荧光染料具有良好的性质，但因其光稳定性差、选择性低等缺陷仍需要构建更加稳定、光毒性低、组织穿透力更强的近红外荧光探针，进而应用于癌症的早期诊断、癌组织切除手术及抗癌化合物代谢筛选等方面，使癌组织达到可视化的目的。