依达拉奉腹腔注射对大鼠缺血性脑损伤的治疗作用及其机制探讨

曹籍文，黄云丽，陈君

(1天津市环湖医院，天津 300350；2天津市脑血管与神经变性重点实验室；3天津市神经病学研究所)

近年来，缺血性脑卒中的发病率居高不下，是致残率和致死率最高的疾病之一，严重威胁着人类健康[1]。脑梗死发生后，会在缺血区诱发一系列复杂的病理生理过程，如脑能量代谢紊乱、氧自由基激活及级联反应、兴奋性氨基酸的毒性作用等。当缺血性脑损伤发生时，小胶质细胞最先被激活，释放大量促炎症因子，在神经细胞病理性损害中起重要作用。因此，尽早恢复缺血区血流供应，减少脑梗死体积，减轻炎症因子损伤，改善神经功能缺损后遗症状，是早期临床治疗的关键，而寻找有针对性的治疗药物也成为学者们的研究热点之一。依达拉奉是一种新型自由基清除剂，能有效延缓病情进展、改善神经症状、抑制神经元凋亡，广泛应用于缺血性脑血管病的临床治疗中。Yuan等[2]证实，给予依达拉奉治疗后，大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠缺血区小胶质细胞与IL-1β、TNF-α、iNOS等促炎性因子共表达减少，其可能通过抑制小胶质细胞活化，减轻脑神经元炎症反应和氧化损伤，在缺血性脑损伤中发挥脑保护作用，但其分子靶点和具体作用机制目前尚不明确。Notch信号通路维持神经元和神经胶质细胞的正常生长发育，也在中枢神经系统疾病的发生发展中起重要作用。研究[3,4]证实，在急性脑缺血发生即刻，瞬时活化的γ-分泌酶介导Notch信号通路激活；Notch-1大量表达于活化态的小胶质细胞，主导调控其激活和炎症因子表达；Notch信号通路参与活化小胶质细胞释放炎症因子，亦有可能通过调控下游NF-κB的核转位参与缺血性脑损伤的病理生理过程[5]。但依达拉奉是否通过Notch信号通路抑制小胶质细胞的文献报道仍少见。2018年8月～2019年1月，我们观察了依达拉奉腹腔注射对大鼠缺血性脑损伤的治疗作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 成年雄性SD大鼠36只，清洁健康8周龄，体质量180～220 g，购自中国军事医学科学院实验动物中心。饲养于无特殊病原菌环境中，自由活动、饮食饮水。所有大鼠采用随机数字表法分为Edv组、MCAO组、Sham组各12只。

1.2 大鼠缺血性脑损伤模型制备及依达拉奉腹腔注射 ①Edv组、MCAO组：均制备缺血性脑损伤模型，即采用Longa等[6]的经典线栓法，行MCAO手术，以制备大鼠缺血性脑损伤模型。大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥，麻醉满意后，取仰卧位固定，消毒皮肤，取颈正中切口，充分暴露右侧颈总动脉和颈内外动脉。依次结扎颈总动脉近心端、颈外动脉及其分支；颈总动脉远心端穿结扎线打活结备用，微动脉夹暂时夹闭；眼科剪在颈总动脉近分叉处剪一小口。将备好的线栓由此口插入，经分叉处沿颈内动脉入颅至大脑中动脉起始部，以阻断大脑中动脉血流。感到轻微阻力时可停止送线，插入深度约18～21 mm，结扎线打结以防止线栓脱出，消毒并缝合皮肤。多普勒血流仪监测大脑中动脉供血区血流量降至术前的50%以下，缺血2 h后退出线栓恢复血供。②Sham组：仅分离暴露血管不做栓塞。术中直至术后动物麻醉苏醒均应注意保暖。Edv组于MCAO术后1 h腹腔注射8 mg/kg依达拉奉，Sham组及MCAO组分别在同时间点腹腔注射同量的生理盐水，连续3 d。

1.3 大鼠神经功能缺损评分 造模后24 h，由两位不明分组的实验人员观察大鼠，依照Longa等[6]的改良评分标准进行神经功能缺损评分：0分，正常，无明显行为学变化；1分，不能完全伸展对侧前肢；2分，能行走，轻微的向对侧转圈；3分，能行走，严重的向对侧转圈；4分，不能行走，向对侧倾倒；5分，意识丧失，无自发活动。

1.4 大鼠脑梗死体积测算 采用氯化三苯四氮唑(TTC)染色法。造模后5 d各组分别取6只大鼠处死，迅速断头取脑，于-20 ℃冷冻30 min后取出。沿冠状面切片，片厚2 mm。将脑片浸入1%TTC染液中，37 ℃水浴避光孵育30 min，期间翻动1次，使染色充分。于4%多聚甲醛中固定24 h后摄片，采用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件分析计算脑梗死体积。采用Swanson等[7]的梗死体积间接计算法，为减少缺血后脑水肿对梗死体积的影响，以非缺血侧体积与缺血侧非梗死区体积两者差值作为校正后的梗死区体积值，采用其与非缺血侧体积的比值的百分数进行比较。

1.5 大鼠脑组织Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白检测 采用Western blotting法。造模后5 d各组另分别取6只大鼠，以2%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位暴露心脏，注射器经左心室穿刺至主动脉，予生理盐水灌注直至右心耳切口流出清亮液体，再取4%多聚甲醛灌注固定。迅速断头取脑，脑组织液氮冷冻后存于-80 ℃备用。取脑组织称重，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，研磨后静置，4 ℃下离心，取上清为总蛋白。取脑组织加入预冷的PBS 1 mL，研磨至匀浆，取上清于4 ℃下离心，弃上清，加入细胞核提取试剂，高速振荡混匀15 s，冰上静置，间断振荡，再次离心取上清液，得核蛋白。BCA法蛋白定量后保存于-80 ℃备用。将蛋白样品与4×蛋白上样缓冲液以1∶3体积混匀，100 ℃煮沸5 min，电泳、转膜、室温封闭，加入一抗兔抗大鼠Notch-1单克隆抗体(1∶1 000)、兔抗大鼠NICD多克隆抗体(1∶500)、兔抗大鼠Hes-1单克隆抗体(1∶500)、山羊抗大鼠Iba-1多克隆抗体(1∶1 000)、小鼠抗大鼠β-actin多克隆抗体(1∶5 000)和小鼠抗大鼠Histone-1多克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜；洗膜，加入二抗羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)、羊抗小鼠IgG-HRP(1∶5 000)或兔抗羊IgG-HRP(1∶5 000)，室温孵育1 h，ECL显影。采用Image J图像软件分析条带的光密度值，以目的蛋白灰度与内参蛋白灰度的比值代表目的蛋白的相对表达水平。

1.6 大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α检测 采用ELISA法。取脑组织称重，加入生理盐水，冰上研磨匀浆，制成10%的脑组织匀浆，4 ℃下离心取上清液，-20 ℃保存备用。按照ELISA检测试剂盒说明书操作，检测IL-6、IL-1β、TNF-α。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分及脑梗死体积比较 大鼠神经功能缺损评分及脑梗死体积比较见表1。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分及脑梗死体积比较

注：与Sham组比较，aP<0.05；与MCAO组比较，bP<0.05。

2.2 各组脑组织Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白表达比较 脑组织Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白见表2。

表2 各组脑组织Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白表达比较

注：与Sham组比较，aP<0.05；与MCAO组比较，bP<0.05。

2.3 各组脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α表达比较 脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α表达比较见表3。

表3 各组脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α表达比较

注：与Sham组比较，aP<0.05；与MCAO组比较，bP<0.05。

3 讨论

缺血性脑卒中是一种脑内血循环异常导致的急性缺血性脑损伤，发病率、复发率、致残率和病死率极高，严重影响患者寿命和生活质量，也给家庭带来沉重的经济负担。缺血性脑卒中临床表现多取决于梗死灶的大小和部位，主要为局灶性的神经功能缺损症状和体征。目前，静脉溶栓是临床上公认最有效的恢复血流、抢救缺血半暗带组织的治疗措施之一[8]。然而，溶栓药物有着严格的时间窗限制，且治疗禁忌证众多，因此能够通过溶栓实现血管再通、改善缺血性脑损伤的仍是少数，多数患者除常规治疗外，需要使用神经保护药物。缺血性脑损伤的发生机制复杂，缺血后炎症反应是导致神经元凋亡、神经功能受损、脑组织形态改变的重要病理过程，小胶质细胞激活在其中发挥重要的作用[9]。激活态的小胶质细胞大量释放炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α等，促进炎症反应发生，作为中枢神经系统的“巨噬细胞”，吞噬病原体和细胞碎片，修复受损神经[10]；但过度活化的小胶质细胞产生细胞毒性因子，导致氧化应激级联反应，反而加重组织损伤，破坏血脑屏障，打乱动态平衡，产生更加持久的损害[11]。

依达拉奉作为一种新型自由基清除剂和脑保护剂，被广泛应用于缺血性脑梗死的急性期治疗。尽管已经证实，依达拉奉具有明确的脑保护作用，但其具体机制尚不清楚。依达拉奉治疗缺血性脑损伤的可能机制包括：①分子量小，脂溶性高，易透过血脑屏障发挥作用；②清除氧自由基，减少细胞膜损伤；抑制脂质过氧化，减少蛋白损伤变性，减小梗死灶面积；抑制线粒体凋亡通路，减少神经元凋亡；③抑制晚期糖基化终末产物，保护血管内皮细胞；调节缺血后花生四烯酸代谢，减少脑水肿；④抑制小胶质细胞活化，减少炎症介质释放等[12～15]。研究证实[16]依达拉奉能减少脑水肿和梗死灶体积，抑制神经元凋亡，延缓神经功能症状，有效改善急性脑梗死的功能结局，有益于远期预后。本研究显示，与Sham组比较，Edv组、MCAO组神经功能缺损评分和脑梗死体积百分比增加；与MCAO组比较，Edv组神经功能缺损评分和脑梗死体积百分比减少。提示依达拉奉对大鼠缺血性脑损伤有治疗作用，其可有效改善缺血性脑损伤大鼠的神经功能症状，减少脑梗死体积。

Notch信号通路在γ-分泌酶作用下激活，裂解释放出Notch-1受体胞内活性片段NICD，可不经其他信号转导分子的作用而直接进入细胞核，调控下游靶基因Hes-1、Hes-5、NF-κB等的表达[17]。以γ-分泌酶为作用靶点可阻断Notch信号通路，其中DAPT(GSI)是最为有效的特异性的γ-分泌酶抑制剂，被广泛应用于实验研究领域[18,19]。Iba-1是一种钙结合蛋白，能与巨噬细胞和小胶质细胞发生特异性结合；当这些细胞激活后，Iba-1的表达相应上调，因此常作为反映小胶质细胞活化程度的标记物使用[20]。Cao等[21]发现，静息及活化状态的小胶质细胞均表达Notch信号通路相关分子。在生理状况下，维持小胶质细胞处于静息状态，通过任何方式激活Notch通路都会导致小胶质细胞迅速活化，产生炎性介质浸润损伤神经元；体外实验中，用LPS处理小胶质细胞后，Notch-1受体表达上调，阻断Notch通路则伴随IL-6、IL-1β及TNF-α等促炎因子表达降低。在沉默Notch基因或使用γ-分泌酶抑制剂的动物模型中，脑损伤状况和缺血后炎症反应明显减轻。并且在脑缺血发生早期抑制Notch信号通路，能明显减轻炎症损伤，更有益于组织修复；而长时间持续阻断Notch信号通路会导致血管新生受抑制，影响神经再生。说明Notch信号通路在疾病进展的不同时期发挥着不同的作用[22]。与相对简单的分子结构相比，Notch信号通路与其他细胞信号通路的交互作用可能相当复杂。目前在神经干细胞和肿瘤细胞研究[23]中，Notch通路与NF-κB、Wnt、TGF/BMP、TLR等通路的相互作用已经被证实。本研究显示，与Sham组比较，Edv组、MCAO组Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白表达升高；与MCAO组比较，Edv组Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白表达降低。与Sham组比较，Edv组、MCAO组IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高；与MCAO组比较，Edv组IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低。提示依达拉奉对大鼠缺血性脑损伤有治疗作用，其机制可能是通过下调Notch信号通路，抑制小胶质细胞活化，减少炎症因子释放而实现。

总之，依达拉奉对大鼠缺血性脑损伤有治疗作用，机制可能为下调Notch信号通路、抑制小胶质细胞活化、减少炎症因子释放。