盐酸奥洛他定滴眼液对过敏性结膜炎小鼠结膜M细胞增殖及白细胞介素4、JAK1、STAT6表达的影响△

杨军 何宏 钟兴武

过敏性结膜炎是一类常见眼科疾病，主要由Ⅰ型和Ⅳ型变态反应引起，常见症状为眼痒，并伴有结膜充血、水肿、滤泡增生等体征[1-3]。根据患者临床表现、病程及预后的差异，大体可分为春季过敏性角结膜炎、常年型过敏性结膜炎、季节性过敏性结膜炎、巨乳头性结膜炎以及特应性角结膜炎，共5种类型[4-6]。M细胞是一种特殊细胞，位于淋巴细胞圆丘部的上皮中，具有抗原吞噬和穿胞运输功能，是人体黏膜免疫体系的重要组成部分，在免疫反应过程中起到重要作用，其在肠道中的作用也受到了深入研究[7-11]。近年来，M细胞在过敏性结膜炎中的作用逐渐引起了人们的重视。本研究通过构建小鼠过敏性结膜炎模型，探讨M细胞增殖与白细胞介素4(interleukin 4，IL-4)-JAK1-STAT6信号通路的联系，为过敏性结膜炎的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取SPF级Barb/c小鼠18只(购自广东省实验动物中心)，5～6周龄，雌性，适应性喂养1周后开始实验。本研究遵循《实验动管理条例物》(2017修订版)的规定。

1.2 主要试剂及仪器盐酸奥洛他定滴眼液[爱尔康(中国)眼科产品有限公司]，卵清蛋白(OVA)和Al(OH)3(美国Sigma公司)，IL-4、JAK1、STAT6 试剂盒(美国R&D Systems)，RT-PCR 试剂盒(日本TAKARA公司)。实验用主要仪器：全自动酶标仪(美国Rayto公司)。山羊抗兔IgG、兔抗鼠AnnexinA5(英国Abcam公司)。

1.3 造模与分组将18只小鼠随机分为空白对照组、模型组、治疗组，每组6只。空白对照组正常饲养；模型组及治疗组分别于开始实验的第1天、第7天，腹腔注射含OVA 100 μg及Al(OH)35 mg的混合液200 μL，进行免疫；第8天至第21天，每眼每天滴加含OVA 100 μg的生理盐水，加强免疫；第24天，每眼滴加含OVA 200 μg的生理盐水，进行激发。治疗组，第25天至第31天，每眼滴加盐酸奥洛他定滴眼液，每天2次，每次1滴；模型组滴加等量生理盐水。实验进行至第33天，眼球取血，处死小鼠，收集血液，室温静置20 min，3000 r·min-1离心15 min，取血清，-80 ℃保存备用；取眼睑，左眼睑置于40 g·L-1多聚甲醛溶液，-20 ℃保存备用；右眼睑置于-80 ℃保存。

1.4 实验方法

1.4.1 免疫荧光法检测各组小鼠结膜M细胞数变化情况以Annexin A5为标志物检测眼睑结膜M细胞数变化。取材通过PFA(0.01 mol·L-1PBS，pH 7.4)固定，经乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，不锈钢模具包埋成组织块。切片，将厚度3 μm的组织切片覆于经多聚赖氨酸覆膜的载玻片上，65 ℃烘烤2 h；二甲苯脱蜡，酒精梯度水化，枸橼酸修复，30 g·L-1牛血清白蛋白室温封闭30 min，一抗(兔抗鼠Annexin A5)4 ℃孵育过夜；洗涤，二抗(羊抗兔IgG)避光室温孵育50 min；DAPI复染细胞核，封片，镜检。

1.4.2 ELISA检测各组小鼠血清中IL-4、JAK1、STAT6含量采用ELISA法测定各组小鼠血清中IL-4、JAK1、STAT6含量，实验步骤按试剂盒说明书进行。

1.4.3 RT-PCR检测眼睑组织中JAK1、STAT6 mRNA相对表达量将眼睑组织研磨破碎，用Trizol试剂盒提取细胞总RNA并检测其浓度，各组以等量总RNA为模板，进行逆转录cDNA后，按照RT-PCR试剂盒(RR420A)SYBR Green法的步骤进行扩增，以β-actin作为内参，引物序列如表1所示，反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，扩增40个循环，每个样本设3个复孔。扩增结束后，统计各个基因的Ct值，采用2-△△Ct法计算各个基因的相对表达量。

表1 RT-PCR引物序列

1.4.4 Western blot法检测眼睑组织中JAK1、STAT6蛋白相对表达量将眼睑组织研磨，提取总蛋白，以β-actin为内参，BCA法定量检测蛋白浓度，每孔上样20 μg。SDS-PAGE电泳，80 V，20 min；120 V，60 min。转膜，100 V，40 min。50 g·L-1脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗孵育过夜，洗膜3次；二抗室温孵育2 h，洗膜3次，加ECL处理，暗室X光胶片曝光。

2 结果

2.1 各组小鼠结膜M细胞数变化情况眼睑结膜组织免疫荧光检测结果显示，模型组标本中M细胞阳性率远高于空白对照组(P<0.05)；治疗组M细胞阳性率有所下降，低于模型组(P<0.05)，但仍高于空白对照组(P<0.05)；推测过敏性结膜炎病程与M细胞阳性率升高有关，见图1。

图1 各组小鼠结膜M细胞染色情况

2.2 各组小鼠血清中IL-4、JAK1、STAT6含量ELISA检测结果显示，模型组血清中IL-4、JAK1、STAT6含量远高于空白对照组(均为P<0.05)；治疗组IL-4、JAK1、STAT6含量均较模型组显著下降(均为P<0.05)；治疗组血清中IL-4、JAK1、STAT6含量均稍高于空白对照组(均为P<0.05)。推测过敏性结膜炎发病过程中伴随血清中IL-4、JAK1、STAT6含量变化。见表2。

表2 各组小鼠血清中IL-4、JAK1、STAT6的含量

注：与空白对照组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05

2.3 各组小鼠眼睑组织中JAK1、STAT6 mRNA相对表达量眼睑组织RT-PCR检测结果显示，模型组JAK1、STAT6 mRNA相对表达量均远高于空白对照组(均为P<0.05)；治疗组JAK1、STAT6 mRNA相对表达量较模型组均显著下降(均为P<0.05)；治疗组眼睑组织中JAK1、STAT6 mRNA相对表达量与空白对照组相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。推测过敏性结膜炎发病过程中伴随眼睑组织中JAK1、STAT6 mRNA含量变化。见表3。

表3 各组小鼠眼睑组织中JAK1、STAT6 mRNA相对表达量

注：与空白对照组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05

2.4 各组小鼠眼睑组织中JAK1、STAT6蛋白相对表达量Western blot检测结果显示，模型组眼睑组织中JAK1、STAT6蛋白相对表达量均远高于空白对照组(均为P<0.05)；治疗组JAK1、STAT6蛋白相对表达量较模型组均显著下降(均为P<0.05)；治疗组眼睑组织中JAK1、STAT6蛋白相对表达量与空白对照组相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。推测过敏性结膜炎发病过程中眼睑组织JAK1、STAT6蛋白相对表达量发生变化。见表4和图2。

表4 各组小鼠眼睑组织中JAK1、STAT6蛋白相对表达量

注：与空白对照组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05

图2 Western blot法检测各组小鼠眼睑组织中JAK1、STAT6蛋白相对表达量

3 讨论

M细胞是人体黏膜免疫系统的重要组成部分，结膜M细胞具有典型的形态学特点和抗原吞噬和穿胞运输功能。研究发现[1，5]，特异性抗原疫苗可以通过结膜给药，利用结膜M细胞特殊的抗原吞噬和传递功能为疫苗疗法提供新的更安全有效的给药策略。过敏性结膜炎发病率高、难以根治，目前治疗手段多集中于局部施加药物抑制炎症因子释放。奥洛他定滴眼液具有双效作用(抗组胺+稳定肥大细胞)，常用于治疗过敏性结膜炎，因此，本研究以盐酸奥洛他定滴眼液作为治疗组用药[12-13]。

国内外研究表明，IL-4、JAK1及STAT6表达异常可引起癌症、肿瘤、过敏等多种疾病[14-16]。本研究通过构建小鼠过敏性结膜炎模型发现，过敏性结膜炎发病过程中M细胞数增加，施加药物处理后M细胞数明显减少，提示M细胞的增殖过程与过敏性结膜炎发病过程相关。本实验结果表明，在不同处理组中IL-4、JAK1及STAT6表达存在差异，模型组异常高表达，治疗组与空白对照组差异不明显，推测IL-4、JAK1及STAT6异常激活可能导致过敏性结膜炎的发生。综合结膜M细胞数变化，推测过敏性结膜炎发病过程中M细胞增殖可能与IL-4-JAK1-STAT6信号通路异常激活有关。