“南海Ⅰ号”船体发掘期间的微生物防治

陈 岳（中国文化遗产研究院 北京 100029）

杜 靖（中国文化遗产研究院 北京 100029）

潘 皎（南开大学 天津 300071）

一、“南海Ⅰ号”船体发掘与保护

“南海Ⅰ号”沉船是迄今为止我国发现的保存最为完整的古代大型远洋船舶。2007年，“南海Ⅰ号”沉船被成功整体打捞出水。后连同打捞沉箱移入阳江市海陵岛广东海上丝绸之路博物馆内，浸没保存于“水晶宫”中。2013年，“南海Ⅰ号”考古发掘和文物保护工作正式启动，在博物馆室内采用饱水发掘法，逐层降低“水晶宫”的水位，自上而下顺序发掘沉箱内的遗存。发掘阶段的文物保护工作主要配合考古作业，开展出水文物的现场稳定性保护。

随着发掘工作的逐步推进，埋藏在海底淤泥和凝结物中的“南海Ⅰ号”木质船体慢慢暴露出来。到本文撰写时，船体内侧已基本展现出来，外侧淤泥也按计划开始清除（图1）。在“水晶宫”水位降低后，高出水位的遗址部分由于失水容易发生硬化、干裂、收缩，从而对船体造成破坏；而已经从淤泥中发掘出的船体部分，暴露在空气中也极易失水干燥，进而会发生收缩、变形，甚至产生断裂和塌陷。为妥善保存“南海Ⅰ号”木质船体，防止这类病害损伤的发生，文物保护工作者在发掘过程中通过多种方式，对遗址和暴露出的船体木质构件开展了长期持续的保湿工作。由最初采用人工喷淋作业的方式，到逐步建立起固定式喷淋系统，再根据考古发掘工作的需要搭建了天车移动喷淋系统，并对天车移动喷淋系统进行了多次升级改造，有效保障了船体保湿工作的进行（图2）。

二、船体微生物病害

广东海上丝绸之路博物馆所处阳江市海陵岛气候温暖，夏季气温高。馆内考古发掘现场环境空气湿度常年维持在70%RH以上，最高可达97.8%RH。在文物保护工作开展初期，曾采取用宣纸、无纺布对船木进行覆盖和用塑料膜对船木进行包裹的方式进行保湿。这样的环境条件和保护措施有利于木质船体的保护，同时也有利于微生物的生长。为了防止木质船体发生霉变、降解等微生物病害，在对“南海Ⅰ号”进行保湿喷淋工作的初期，保护工作者在喷淋液中加入了硼酸、硼砂作为防霉剂。

在后续“南海Ⅰ号”沉船现场保护工作实施过程中，在木质船体表面发现了一些白色粉末状、絮状物质（图3）。这些白色物质呈区片状，广泛分布于船体各区域，且随时间推移其分布区域和面积有增加的趋势。

对这些白色物质进行提取，并在4℃条件下保存至实验室，进行显微镜观察。结果发现少量样品在显微镜下呈颗粒状，无明显菌丝状的微生物，应该是由船木中析出的海盐类物质；而大部分样品在显微镜下有明显的呈菌丝状微生物细胞，菌丝直径为7-10μm，判断为真菌（图4）。由此可知，硼酸、硼砂对此种微生物没有起到有效的抑制作用。为了明确微生物病害情况，开展有针对性的治理措施，对滋生于“南海Ⅰ号”木质船体表面的微生物进行了取样分析。

三、微生物检测分析

为尽可能揭示“南海Ⅰ号”木质船体表面的微生物群落组成，微生物检测分析采用了克隆文库和高通量测序相结合的方法。

（一）样品采集

用手术刀刮取微生物样品放在灭菌离心管，然后立即放置在加有冰块的保温桶内保存至实验室。

（二）DNA提取

选用MO BIO公司的“土壤DNA提取试剂盒”（PowerSoil DNA Isolation Kit），对“南海Ⅰ号”船体样品进行前处理并提取样品总DNA。

（三）克隆文库

细菌选用扩增细菌1 6 s r D N A的通用引物341f-907r，真菌选用扩增真菌18s rDNA的通用引物ITS1-ITS4：

341f：5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’

907r：5’-CCCCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

PCR反应条件为，反应体系：模板2μL，10×Taq酶buffer 2.5μL，dNTP（2.5mM）2μL，引物（10μM）各1μL，Taq酶（5U/μL），加灭菌ddH2O至25μL。条件：94℃预变性3min，94℃变形30s，54℃复性30s，72℃延伸40s，30个循环；最终72℃延伸10min。

用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将得到的PCR产物均采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit进行纯化回收。

依照TaKaRa公司提供的pBackZero-T Vector Cloning Kit载体建立连接体系：PMD19-T vector 1μL（50ng/μL），solution I 5μL，PCR产物84ng，灭菌去离子水加至10μL，16℃金属浴12h。感受态细胞为TaKaRa公司提供的Escherichia coli DH5α菌株，转化，将细胞均匀涂布在含氨苄青霉素（终浓度100μg/mL）的固体LB培养基上，37℃培养过夜。

随机挑取克隆文库中白色菌落，每份样品挑取20～40个克隆，进行菌落PCR，验证其是否为正确的转化子，同时点备板放到37℃进行培养，把正确的转化子进行测序。菌落PCR中，细菌使用引物341f-907r，真菌使用引物ITS1-ITS4。

（四）高通量测序

将点好的转化子平板进行测序，获得的序列与GenBank比较，根据数据库中同源序列判断所得序列的种属。统计每份样品获得的微生物序列的次数，判断样品所感染的主要微生物种类，采用以下标准（S：待测序列与数据库中序列相似度）：

细菌16s rDNA：S≥97%，同种；85＜S＜97%，同属。

真菌ITS：S≥99%，同种；95＜S＜99%，同属。

四、检测结果与讨论

（一）克隆文库结果

N H I-1号样品的原核生物中，芽孢杆菌属（Bacillus）占总克隆数比例为72%，是主要原核致病菌，其次是硫杆菌属(Filobacillus)占总克隆数比例为25%，其余未知的克隆占比相对较低。NHI-1号样品的真核生物中，镰刀菌属（Fusarium）占总克隆数比例97%，是主要真菌致病菌。

N H I-2号样品的原核生物中，海源菌属(Idiomarina）占总克隆数比例为67%，是主要原核致病菌，其余的克隆占比相对较低。NHI-2号样品的真核生物中，镰刀菌属（Fusarium）占比例为97%，是主要真菌致病菌。

（二）高通量测序结果

N H I-1号样品的原核生物中，盐单胞菌属（Halomonas）占细菌总数的14%，未知菌占细菌总数的72%，其余种属占比相对较低。NHI-1号样品的真核生物中，镰刀菌属（Fusarium）占比为97%，为主要真菌致病菌。

N H I-2号样品的原核生物中，海源菌属(Idiomarina）占细菌总数的26%，是主要原核致病菌，其次是盐单胞菌属（Halomonas）占细菌总数的12%，未知菌占比为40%。NHI-2号样品的真核生物中，镰刀菌属（Fusarium）占比为97%，是主要真菌致病菌。

（三）结果讨论

无论是克隆文库测序还是高通量测序的结果，NHI-1及NHI-2的主要病害真菌都是镰刀菌属（Fusarium），且在克隆文库测序与高通量测序结果中所占的比例相同，都是97%。在细菌方面，NHI-2样品在两种方法的测试结果中都是海源菌属(Idiomarina）所占比例最大；而NHI-1样品在克隆文库测序结果中较多的是芽孢菌属（Bacillus），在高通量测序结果中除去未知菌外，最多的是盐单胞菌属（Halomonas）。

其中镰刀菌在土壤和各种有机质等环境中广泛分布，可以降解木材中的纤维素、木质素和木聚糖，为木材危害很大。镰刀菌属中腐皮镰刀菌（Fusarium solani）可以产纤维素酶[1][2]。Lozovaya等人的研究表明腐皮镰刀菌（Fusarium solani）在感染大豆根部的过程可降解木质素，而且孢子萌发过程中产生的细胞壁降解酶可促进其侵染效率[3][4]。NORRIS从木材中分离到的腐皮镰刀菌（Fusarium solani）可分解芳香酸和木质素[5]。Saparrat等人的研究表明腐皮镰刀菌（Fusarium solani）可以产低活性胞外MnP和MIP两种与木质素降解有关的酶[6]。此外，降解木质素过程中的关键酶漆酶在腐皮镰刀菌（Fusarium solani）中也有发现[7][8]。镰刀菌属中的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）除了能产生纤维素酶之外，还能产生木聚糖酶[9][10]。

五、微生物治理效果

通过对“南海Ⅰ号”木质船体上的微生物开展检测分析，可以了解到其中最主要的病害微生物是镰刀菌，其对船体木材的安全保存威胁最大，应作为主要治理对象。

通过对相关微生物抑制剂的筛选，发现采用复配的异噻唑啉酮对镰刀菌的抑制效果最好（图5），且其具有广谱性、高效性及环境友好性等优点，对人体无害，适合用于考古发掘现场。

之后，在“南海Ⅰ号”木质船体保护工作中，向船体喷淋保湿液中添加了复配的异噻唑啉酮溶液，以此对船体的微生物病害开展治理。分别在开展治理后6个月和12个月进行观察，明显可见白色菌斑逐步消退（图6）。进一步分析结果也显示镰刀菌属在木质船体表面微生物群落中占比明显降低。

结语

“南海Ⅰ号”独特的发掘方式和保存环境是造成其产生镰刀菌病害的主要原因。海洋出水沉船往往采用水下考古作业的方式进行发掘，在被打捞出水后也多采用浸没保存的方式。在这个过程中，沉船木材绝大部分时间与空气隔绝，从而不利于镰刀菌的生长。“南海Ⅰ号”沉船的考古发掘环境温暖高湿，有利于镰刀菌的生长，船体木材中的纤维素、木质素、木聚糖等成分又为镰刀菌提供了养料。这些因素共同造成了微生物病害的产生。通过鉴别致病微生物种类，筛选具有针对性的抑菌剂，“南海Ⅰ号”船体的微生物病害得到了有效治理。下一步，应合理控制抑菌剂用量防止病菌产生耐药性，同时开展备用抑菌剂的筛选工作，以保障“南海Ⅰ号”木质船体的长期安全保存。