姜黄素分光光度法测定水中硼的优化检测条件研究

邢书才 杨永 岳亚萍

摘要：针对姜黄素光度法测定水中硼分析方法存在的问题，研究和优化分析测定的实验条件。采用方法研究的方式，对样品显色反应的蒸发条件进行改良，用普通烘箱替代水浴条件，对样品进行显色和蒸发处理;同时，通过对分析方法校准曲线标准点的重新设置，拓宽方法测定范围，也使校准曲线的线性以及精密度得以显著提高。补充试剂空白试验，增加测定下限处的标准点;并从分析测定质量控制角度，对校准曲线制备中，0.10～1.00mL标准溶液过小的加入量进行改进，变为统一体积量的一致性加入，减小了分析误差的几率。研究结果表明，改良后的实验条件，分析方法的检出限为0.019mg/L，测定下限为0.076mg/L;测定范围为0.080～1.4mg/L，比改进前拓宽了40%。精密度测定结果相对标准偏差小于3.0%，准确度的检验结果符合方法学的技术要求。改进后的分析方法，测定下限低，范围广，灵敏度高;适合于水和废水中硼的分析测定。

关键词：硼;姜黄素;分光光度法;测定条件

中图分类号：O657.3;X832 文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2019）06-0065-05

收稿日期：2019-01-22;收到修改稿日期：2019-03-05

基金项目：生态环境部国家标准制修订项目（2018-16）

作者简介：邢书才（1958-），男，北京市人，教授级高级工程师，主要从事环境监测和国家标准的研究。

0 引言

分光光度法測定水和废水中硼，是环境监测和分析检测实验室普遍采用的分析方法。现行检测硼的标准分析方法，主要有GB/T5750.5-2006《生活饮用水标准检验方法无机非重金属指标》和HJ/T49-1999《水质硼的测定姜黄素分光光度法》[1-2]。其中姜黄素分光光度法作为国家环境保护标准分析方法，已经实施了近20年;在分析测定应用中，显现出该方法操作较为繁琐，实验条件比较苛刻，需在无水条件下进行。同时存在校准曲线的试剂空白缺失，测定下限与实际情况偏离较远，测定范围过于狭窄，以及样品和校准曲线制备中取样量过小，易于产生分析误差等问题;这些因素都不同程度地影响到分析测定的质量。分光光度法测定硼的分析实验，以往已有一些文献报道[3-11]，对于姜黄素光度法测定水中硼的研究，文献报道较少，且主要涉及分析方法的应用和方法比对方面[12-15];对分析方法中存在问题的改进性研究，近年来未见有报道。本工作针对姜黄素分光光度法存在的问题，进行了方法改进和针对性研究;简化了样品显色和蒸发装置，补充了试剂空白，降低了测定下限，拓展了分析方法的测定范围;实验操作质量控制方面的改进，改善了校准曲线线性不理想、回归系数较差的问题，提高了校准曲线的精密度;使分析测定的实验条件得到优化，提高了分析测定的精密度和准确度，取得了满意结果。

1 实验部分

1.1 要设备

Cary300UV-Vis型光谱仪（安捷伦）;塑料烧杯、试剂瓶、25ml成套具塞（PP）塑料比色管，日本NIKKO公司生产;移液管、容量瓶（PP材质，Brand）;瓷蒸发皿;恒温水浴槽;恒温烘箱。所有器皿不得使用含硼玻璃材质器皿。

1.2 主要试剂

硼标准贮备液（1000mg/L）（钢研纳克，AccuStandard）;硼标准使用液（1.00mg/L，10.00mg/L）;硼标准样品（GSB07-1979-2005）：盐酸，草酸，姜黄素，无水乙醇（AR，上海化学试剂有限公司）。

姜黄素+草酸溶液：于80mL无水乙醇中加入草酸5.0g及姜黄素0.040g，溶解后再加入浓盐酸4.2mL，移入100mL容量瓶用乙醇定至刻度。

1.3 实验方法

1.3.1 校准曲线的制备

1）原方法：按照HJ/T49-1999《水质硼的测定姜黄素分光光度法》的实验步骤，配制各标准点浓度溶液，测定后制备校准曲线。测定体系的浓度按照总体积为1.00mL计算。

操作方法：向一系列蒸发皿中分别加入0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL（1.00μg/m1）的硼标准使用液，并分别加入0.80，0.60，0.40，0.20mL去离子水，使溶液总量为1mL，分别加入姜黄素-草酸溶液4.0ml，，将蒸发皿轻轻摇动使溶液混匀，置蒸发皿于（55±3）℃的水浴上蒸发至干，并继续于水浴上保留15min后取下蒸发皿，放置至室温后，用少量乙醇溶解并转入25ml，比色管中，用乙醇稀释至刻度，离心后，用2cm比色皿，于波长540nm处，以纯水为参比，测定吸光度。

2）改进法：参照HJ/T49-1999《水质硼的测定姜黄素分光光度法》的条件步骤，改变标准使用液的加入方法，最终用一致性体积的加入方法，制备校准系列溶液;加入显色剂后改用在（55±1）℃的烘箱中蒸发至干，然后按分析步骤进行测定，绘制校准曲线。测定体系的浓度按照总体积为1.00mL计算。

操作方法：在7个100mL容量瓶中，分别加入10.00μg/mL的硼中间液0.00，1.00，2.00，4.00，8.00，12.00，14.00mL，以纯水定容摇匀，1～7号容量瓶中硼的浓度为0.00，0.10，0.20，0.40，0.80，1.20，1.40μg/mL;各取1.00mL于1～7号蒸发皿中，1～7号蒸发皿中含有硼的质量为0.00，0.10，0.20，0.40，0.80，1.20，1.40μg，分别加入姜黄素-草酸溶液4.0mL，将蒸发皿轻轻旋动使溶液混匀，然后将蒸发皿置于（55±1）℃的烘箱中蒸发至干，继续保持15min，取出蒸发皿，冷却至室温，用少量乙醇溶解后转入25mL比色管中，用乙醇稀释至刻度，离心后，用2cm比色皿，于波长540mm处，以纯水为参比，测定吸光度。

1.3.2 样品的测定

1）原方法：吸取样品1.0mL（硼含量不超过1.0μg）于蒸发皿中，以下按1.3.1的1）的实验程序测定，将吸光值带入1.3.1的1）校准曲线中计算出硼浓度值。

2）改进法：吸取样品1.0mL（硼含量不超过1.4μg），按1.3.1的2）实验程序测试，把吸光值带入1.3.1的2）校准曲线中计算出硼浓度值。

2 结果与讨论

2.1 检定下限与检定范围的改良

对改进前及改进后的检测方法制备的系列浓度标准点进行测定，并分别制备校准曲线（如图1，图2所示）进行比对分析。

按分析方法标准制修订技术导则的相关规定[16]，分析方法的检出限可由校准曲线的的参数计算：检出限=0.01×b^-1（检测下限为4倍的检出限）。由此可计算出原方法的检出限和检测下限分别为0.022mg/L和0.086mg/L;改良后方法的检出限和检测下限分别为0.019mg/L和0.076mg/L，较原方法降低了近14%左右。

从检测范围上，改进前后方法的检测范围分别为0.10～1.0mg/L和0.080～1.4mg/L，改良后校准曲线线性良好，精密度较高，检测范围较原方法拓宽了40%之多。

2.2 蒸发装置和质量控制的改进

由图1可见，改进前方法的校准曲线，线性欠佳，数次重复性实验，线性均不理想。原因有多方面，实验过程操作较为繁琐复杂，校准曲线制备过程取样量过小，以及被测样品取样量过小都蕴含分析误差因素。实验中样品所需蒸发时间，蒸发的速度，脱水等条件，都要求有较高的一致性程度。前消解中稍有操作不当容易造成样品损失甚至实验失败的结果。同时，冗长复杂的操作以及显色基团稳定性原因，都可能造成实验分析误差。

以取样量误差分析，原方法校准系列的取样量为0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL，还要分别补水至1.00mL的过程。以1.00mL为例，在取样过程如果出现1滴溶液（约0.05mL）的损失，造成的相对误差为5%。相对于0.20，0.40，0.60mL，将会造成更大的误差。为了控制取样量的误差因素，本研究预先配制与校准系列浓度相同的系列浓度标准使用液，采用在7个蒸发皿中一致性加入1.00mL标准使用液的方法，对取样量的误差因素进行控制（详见1.3.12））。从图2可见，经重复性比对实验，改进后分析方法的校准曲线，从线性质量和精密度上都有了较大提高。

同时，对方法实验的蒸发装置进行了改进。原分析方法是利用水浴控制（55±3）℃，对样品进行显色和蒸发脱水。现改为在烘箱中进行这一步骤，其优点在于相对于水浴，空气的热传导是多方向传导，可使样品反应受热更均匀，温度更加易于控制;样品置于烘箱的托盘之中，相对于水浴，更加有利于样品的安全性，也相对降低了实验成本，更有利于大批量样品的处理。

2.3 校准曲线标准点设置上的改进

对于一种相对测定的分析方法，分光光度法的校准曲线，其中标准点的设置有特定的规则和技术上的要求。根据精密度要求，标准浓度点在布置上要中间范围稀少，而在曲线的两端相对性地密集设置，改良前校准曲线在标准点的分布上，采用的是等均性方式设定（见图1）;改良后的校准曲线采用的是中部疏散两端密集的布置方式，并根据实际测定下限的测定值设定定量下限浓度点，有利于低浓度样品的测定;益于校准曲线的质量及精密度的提高，符合分析测定质量控制和方法学要求[16-17]。实际测定结果也表明，相对于原测定方法，无论是校准曲线的线性指标，还是曲线的精密度都有了显著性提高，为分析方法的准确测定提供了技术上的支持和基础。

2.4 试剂空白的补充改进

对于分析方法研究，主要涉及分析方法的精密度、准确度和空白分析。可见空白试验是分析方法研究的一个不可缺少的方面。对于分光光度法，是一种相对测定方法，就其试剂空白而言，不仅关系到测定平台问题，也可以通过试剂空白预知和判断试剂干扰情况，也就是分析判断测定体系背景干扰的大小。如上所述，分光光度法作为一种相对测定方法，参比溶液是其中的测定平台，试剂空白往往受到操作环境、仪器状态以及试剂等多方面因素的影响，其中以试剂造成的影响为主。实际测定中，有的分析方法使用纯水为参比，有些分析方法使用试剂空白为参比溶液。在一个实验分析测定过程中，什么情况下使用纯水为参比，什么情况下使用试剂空白为参比，要依具体情况而定。而对试剂空白的测定情况，就是判断以纯水还是试剂空白为参比溶液的重要依据。

姜黄素分光光度法测定水中硼，使用纯水为参比溶液，在校准曲线的制备过程中，校准系列中的试剂空白是缺失的。所带来的问题是在实验分析中，无法根据试剂空白的大小判断背景干扰情况，也不利于确认参比溶液的选择或参比溶液的灵活选择。本实验在原测定方法中增加了测定的试剂空白实验，使测定方法中的缺失趋于完整，也使测定方法在整体上更加趋于合理。

经实际重复测定，姜黄素光度法测定水中硼的试剂空白值，吸光度在0.026～0.040左右，试剂空白值稍大，有一定的背景干扰。《水和废水监测分析方法（第四版）》相关方法[1B]，使用试剂空白为参比;HJ/T49-1999《水质硼的测定姜黄素分光光度法》使用纯水为参比。由于考虑到试剂空白值较高，同时考虑到实验是在乙醇介质中进行，乙醇的易挥发性影响试剂空白作为参比时的稳定性，易使比色皿中参比液的透光率發生改变，使分析测定受到影响;经实际测定，60min后，试剂空白的吸光值变化了0.004，而纯水未发生变化;相对而言，纯水的稳定性是肯定而相对持续的。因此，在这种前提条件下，以纯水为参比是一种较为适宜的实验条件选择。

2.5 精密度和准确度测定

按照方法研究的基本要求[16]，用硼标准贮备液配制（高、中、低）3种不同浓度样品后进行实际测定，用以验证改良方法精密度情况。准确度的检查，用水质硼标准样品进行实际测定的验证。测定结果分别汇列在表1、表2中。

从表1列出的测定结果可见，对高、中、低3种浓度样品的测定结果显示，测定结果与样品值一致性较好，相对标准偏差最大值小于3%;说明分析方法的精密度良好。

由表2对硼标准样品的测定数据可以看出，原测定方法和改进后测定方法的测定均值，分别为1.05mg/L和1.03mg/L，分別用t检验法与标准值进行检验，检验结果t_原方法=2.31，t_改进法=1.40，均小于临界值t_{（0.05，5）}=2.45。说明测定结果与标准值没有显著性差异。同时对改进前和改进后方法测定结果的均值进行t检验，检验值t_实验=137（0.05，10）