小茴香精油成分测定及性能研究

姜楠楠，陈小亮，董娜，王建清

(1.河南工学院，河南 新乡 453000；2.天津科技大学，天津 300222)

小茴香(FoenicuzuvulgareMill.)为伞形科植物茴香的干燥成熟果实，不仅是一种调味品，而且是传统中药。钟瑞敏等针对小茴香籽精油对7种食源性致病菌和2种腐败性真菌进行抗菌活性研究，小茴香籽精油表现出优良的广谱性抗菌活性，其中黑曲霉和副溶血性嗜盐菌对该精油的最小抑菌量(MIC)分别小于0.004%和0.015%(体积分数)[1]。陈佳丽等从烧鸡中分离、鉴定出腐败菌为产黄青霉菌，将小茴香等香辛料对其腐败菌进行抑菌效果研究，最小抑菌浓度为0.8 g/mL[2]。

本文采用水蒸气蒸馏法从小茴香果实中提取精油。采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析小茴香精油的化合物成分，对其进行定性与定量。通过傅里叶红外光谱对小茴香精油主要成分在光照时长与pH值条件下的稳定性进行分析。并对小茴香及其主要成分对青霉的抑菌效果进行测试，显示效果良好。通过对小茴香及其主要成分测定及性能分析，为小茴香的进一步开发利用研究提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验所用材料

小茴香(食品级)：甘肃省安国市祁澳中药饮片有限公司；95%乙醇(分析纯)、蒸馏水、草酸(分析纯)：天津基准化学试剂有限公司；氯化钠(分析纯)、蔗糖(分析纯)：天津市江天化工技术有限公司；琼脂(生物试剂)：天津市珠江卫生材料厂；反式茴香脑标准品(色谱纯)：Sigma-Aldrich公司；4-烯丙基苯甲醚标准品(色谱纯)：ACROS公司；青霉(生化试剂)：天津科技大学食品与生物技术学院。

1.2 实验所用仪器与设备

HY34型电子天平 奥豪斯仪器有限公司；AR2130型千分之一电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；FW177型中草药粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；DGG型电热鼓风干燥箱 天津天宇机电有限公司；Varian 4000MS型GC-MS色谱仪 美国瓦里安公司；Eppendorf型移液枪 北京东南仪诚试验室设备有限公司；DHP-9052型电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；Check Mate 9900型气体分析仪 丹麦拔萃公司；VECTOR 22型傅立叶变换红外光谱仪 德国布鲁克仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 小茴香精油提取

图1 常压水中蒸馏装置

1.3.2 小茴香精油成分分析

1.3.2.1 小茴香精油GC-MS分析

色谱条件：柱子型号：VF-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度：300 ℃；分流比：100；载气：He，99.999%；流速：1 mL/min；程序升温：初始温度100 ℃，然后以10 ℃/min升至300 ℃，保持10 min。质谱条件：离子源：EI；离子阱温度：220 ℃；传输线温度：280 ℃；扫描方式：全扫描；扫描范围：50～500 m/z。利用NIST05 标准质谱库-计算机联机检索。

1.3.2.2 小茴香精油主要成分定性/定量分析

定性分析：取1 mL样品稀释1000倍取1 μL进样，利用NBS75K标准质谱库-计算机联机检索，与质谱图集的标准谱图进行对照，结合有关文献进行人工谱图解析，确认样品中的各个化学成分及其相对含量。

定量分析：取样品、主要成分的标准品分别稀释1000倍，再分别稀释到100，50，20，10，5 mg/L，然后各取1 μL进样，在同等的条件下进行GC-MS分析。运用气相色谱外标法建立样品的标准曲线，计算出主要成分的绝对含量。

1.3.3 小茴香精油主要成分稳定性分析

采用傅里叶变换红外光谱仪对反式茴香脑和4-烯丙基苯甲醚标准品的稳定性进行分析。具体方法：采用压片法，取干燥的KBr粉末0.15 mg，在玛瑙研钵中研细混合均匀后，加入压模内，制成一定直径及厚度的透明片。在此薄片上滴少许标品经自然光照射0，1，2，3，4，5 h后，将此薄片放入仪器光束中进行测定，扫描范围为500～4000 cm-1。以官能团变化评价光照对稳定性的影响。将4-烯丙基苯甲醚和反式茴香脑通过NaOH醇溶液和HCl醇溶液稀释至pH 2和pH 10的酸碱溶液，静置1 h用KRS5液体红外检测池测定其红外吸收波峰，以官能团的变化评价pH值对稳定性的影响。

1.3.4 小茴香精油抑菌效果实验

1.3.4.1 试样准备

供试菌株的制备：选取的供试菌株为青霉，分离自发病樱桃果实。将供试菌种转接到相应的斜面培养基上，置于28 ℃培养48 h。取2支供实验用，其余冷藏备用。

培养基的制备：具体配方：马铃薯200 g，蔗糖(或葡萄糖)20 g，琼脂14～20 g，水1000 mL，pH自然。制作要点：马铃薯去皮，切成块煮沸30 min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至 1000 mL。分装，高压湿热灭菌(121 ℃，20 min)备用。

菌悬液的制备：挑取菌落接种平皿，霉菌培养48 h，用无菌生理盐水洗脱，玻璃珠打散，制成菌悬液，调菌悬液浓度为107CFU/mL备用。

1.3.4.2 抑菌活性研究(滤纸片扩散法)

将直径为6 mm的圆形空白滤纸片经160 ℃干热灭菌2 h后，无菌条件保存备用。用无菌移液器吸取活化并调整好菌液浓度的各菌悬液0.3 mL加入到已倒好培养基的培养皿中，干热灭菌玻璃涂布器将菌悬液涂布均匀。将无菌滤纸片放入培养皿中央，用无菌移液枪吸取10 μL植物提取物到滤纸片上，每种菌平行做2个皿，然后用相应的提取溶剂作阴性对照。细菌在生化培养箱中37 ℃恒温培养24 h，霉菌在生化培养箱中28 ℃恒温培养48 h，采用十字交叉法量取抑菌圈直径，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 小茴香精油成分分析

2.1.1 小茴香精油GC-MS 分析

按1.3.2中气相色谱-质谱(GC-MS)条件对水蒸气蒸馏提取制得的小茴香精油进行成分分析，其GC色谱图总离子流图见图2。利用NIST05 标准质谱库-计算机联机检索系统，与质谱图集的标准谱图进行对照、复合，结合有关文献确定小茴香精油主要化学成分，再结合毛细管气相色谱面积归一化法对各组分的相对含量进行计算，分析鉴定结果见表1。

图2 小茴香水蒸气蒸馏提取物的总离子流图

峰号化合物名称保留时间(min)百分含量(%)1异丙基甲苯3.4380.1762双戊烯3.4961.2993桉叶油3.5620.12644-异丙基-1-甲基-1,4-环己二烯3.8100.7225松油烯4.1830.02661,3,3-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-酮4.3171.17472,6-二甲基-2,4,6-辛三烯4.7100.0278左旋樟脑5.2970.04394-萜品醇5.8110.064104-烯丙基苯甲醚6.093.996112,4,6-三甲基苯甲醛7.2370.20912对甲氧基苯甲醛7.3970.04313反式茴香脑8.02592.03

2.1.2 小茴香精油主要成分的定性、定量分析

2.1.2.1 小茴香精油主要成分定性分析

GC-MS相同条件进样，保留时间一致可判定为同种物质。4-烯丙基苯甲醚、反式茴香脑标准品和小茴香精油的总离子流图谱的对比。由图3可知，4-烯丙基苯甲醚和反式茴香脑是小茴香提取物的主要化学成分，总离子流图谱出峰时间与化合物的种类相对应，所以判定小茴香提取物总离子流图谱中第一个主要峰代表4-烯丙基苯甲醚，第二个主要峰代表反式茴香脑，此结果进一步验证了NIST05 标准质谱库分析结果，与钟瑞敏、郭婷婷等[3]关于小茴香主要成分的报道相一致。总离子流图谱上的峰面积代表该化学成分的相对含量，由图3可知，小茴香提取物中反式茴香脑的含量高于4-烯丙基苯甲醚。

图3 反式茴香脑、4-烯丙基苯甲醚标品与小茴香提取物的总离子流对比图

2.1.2.2 小茴香精油主要成分定量分析

反式茴香脑和4-烯丙基苯甲醚标品根据GC-MS条件依次稀释至5,10,20,50,100 mg/L等一系列浓度后，气相色谱质谱分析得5个浓度总离子流图谱[4]，见图4和图5。

图4 不同浓度下4-烯丙基苯甲醚标准品的总离子流图谱

图5 不同浓度下反式茴香标准品的总离子流图谱

分别记录4-烯丙基苯甲醚和反式茴香脑在不同浓度相对出峰面积，以浓度为横坐标，相对峰面积为纵坐标分别做4-烯丙基苯甲醚和反式茴香脑的标准曲线，见图6和图7。

根据图4的图谱分析结果，以浓度为横坐标，相对峰面积对纵坐标，运用气相色谱外标法建立样品的标准曲线，见图6。由标准曲线得4-烯丙基苯甲醚线性回归方程为y=1863x+4544.7。将稀释10000倍的小茴香精油在同样条件下进样，利用毛细管气相色谱面积归一化法计算小茴香挥发油中4-烯丙基苯甲醚和反式茴香脑相对含量，代入标准曲线方程多次进样取平均值，结果表明小茴香精油中4-烯丙基苯甲醚绝对含量为32.23 mg/mL。

图6 4-烯丙基苯甲醚浓度标准品曲线

根据图5的图谱分析结果，以浓度为横坐标，相对峰面积对纵坐标，运用气相色谱外标法建立样品标准曲线，见图7。由标准曲线得反式茴香脑的回归方程y=2301x-9205。将稀释10000倍的小茴香精油在同样条件下进样，利用毛细管气相色谱面积归一化法计算反式茴香脑相对含量，代入标准曲线方程多次进样取平均值，结果表明小茴香精油中反式茴香脑绝对含量为96.7 mg/mL。

图7 反式茴香脑线性回归图

2.2 小茴香精油主要成分稳定性研究

2.2.1 反式茴香脑稳定性分析

图8 傅里叶红外光谱法反式茴香脑对不同 pH值的稳定性分析

由图8可知，处理后的红外谱图相对于空白样，无能量的偏移和价键的生成，说明反式茴香脑比较稳定，pH值没有引起其结构发生改变。

图9 傅里叶红外光谱法反式茴香脑对光照的稳定性分析

经不同光照时间照射组与未经过光照照射组对比，红外光谱图变化不大，只有在3417 nm处光照1 h样品吸收峰较大，这可能是由于此样品量相对于其他组较多，从而使此处价键的吸收峰值变大，属于误差影响导致[6]。综上所述，反式茴香脑对光照时长变化、pH值变化条件均比较稳定，这些因素的改变没有引起其结构性质发生改变。

2.2.2 4-烯丙基苯甲醚稳定性分析

选取不同pH值和光照时间为研究对象，通过傅里叶红外光谱对4-烯丙基苯甲醚进行分析，见图10和图11。

图10 傅里叶红外光谱法4-烯丙基苯甲醚对pH值稳定性分析

图11 傅里叶红外光谱法4-烯丙基苯甲醚对光照的稳定性分析

用NaOH醇溶液和HCl醇溶液将4-烯丙基苯甲醚和小茴香精油稀释到相同浓度10-3后，测定其在pH 2和pH 10条件下的红外光谱图[7]。由图10可知，酸碱处理后分子价键无偏移和伸缩震动，说明没有新的价键生成和减少。只是在3423 nm处，相对于空白样，酸碱处理后峰的强度增大，这可能是氢键结合醇和羧酸能力增强所导致的[8]。由图11可知，不同光照时间处理后，处理组相对于对照组几乎没有变化，说明4-烯丙基苯甲醚对光不敏感，光照对稳定性影响不大。

2.3 小茴香精油主要抑菌成分筛选

小茴香、反式茴香脑、4-烯丙基苯甲醚对青霉抑菌6 d后效果图见图12[9]。

图12 小茴香精油及其主要成分对青霉抑菌效果图

由图12可知，6 d后小茴香对青霉抑菌圈直径为9 cm 。对比反式茴香脑和4-烯丙基苯甲醚的抑菌效果发现，同样时间下4-烯丙基苯甲醚抑菌圈直径较小，为4 cm，而反式茴香脑培养皿刚刚有菌丝生长，说明反式茴香脑的抑菌效果较好，并优于4-烯丙基苯甲醚[10]，证明小茴香中起到抑菌作用的主要成分为反式茴香脑。

3 结论

采用水蒸气蒸馏法从小茴香中提取精油。通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对小茴香水蒸气蒸馏提取精油进行定性分析，结果表明：小茴香精油主要成分为反式茴香脑和4-烯丙基苯甲醚。用毛细管气相色谱面积归一化法计算小茴香挥发油中4-烯丙基苯甲醚和反式茴香脑相对含量，代入标准曲线方程多次进样取平均值得反式茴香脑和4-烯丙基苯甲醚绝对含量分别为96.7 mg/mL和32.23 mg/mL。

采用傅里叶红外光谱(FRIT)技术对小茴香精油两种主要成分在光照、pH 2与pH 10的条件下测试稳定性，结果表明：酸碱条件与光照时间变化条件没有引起反式茴香脑和4-烯丙基苯甲醚新官能团生成和能量的偏移，说明酸碱条件与光照条件对其稳定性的影响极小。

研究小茴香及其两种主要成分对青霉的抑菌效果，结果表明反式茴香脑抑菌效果最好，优于4-烯丙基苯甲醚。