肤悦康洗剂对豚鼠湿疹皮损的修复机制

张玲， 林素财， 郑永平

（广州中医药大学附属中山市中医院皮肤科，广东中山 528400）

慢性湿疹是一种炎症性皮肤病，由多种因素引起，可以持续数月、数年甚至数十年，主要表现为明显的瘙痒、渗出、水肿，高复发[1]。目前仍缺乏有效的治疗方法[2]。传统治疗方法如口服抗组胺药、免疫抑制剂、外用皮质类固醇等都易使病情反复发作。物理治疗如液氮冷冻、二氧化碳激光、使用同位素和释放浅层X线等的有效性和安全性都难以令人满意，其应用也因此受到限制。肤悦康洗剂作为中药制剂，临床上在治疗急性和亚急性湿疹方面具有较好效果[3]，然而肤悦康洗剂在治疗湿疹方面的作用机制尚未明确。

自1951年开始将豚鼠模型作为一种可靠的医学动物模型在皮肤病学中使用[4]。2，4-二硝基氯苯（DNCB）诱导的皮肤刺激模型与湿疹在病因、临床表现和病理变化等方面有许多相似之处[5]。故本研究选用DNCB诱发制备豚鼠湿疹模型。本课题组既往实验表明，DNCB诱导的豚鼠湿疹皮肤组织病理检查见不同程度的表皮细胞变性，真皮有不同程度的血管扩张、充血和水肿以及大量炎症细胞浸润，浓度不小于1.2 g/mL的肤悦康洗剂可有效改善该皮损病理改变[6]。为进一步探讨肤悦康洗剂对豚鼠湿疹的抗炎作用，本研究以DNCB豚鼠湿疹模型为研究对象，观察其对豚鼠湿疹皮肤组织细胞因子的影响，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级雌性Hartley豚鼠36只，体质量200～240 g，4～5周龄，由广东实验动物中心提供[生产许可证号：SCXK（粤）2016-0041]。实验于中山市中医院实验室[使用许可证号：SYXK（粤）2015-0109]（屏障环境）完成。动物实验过程中执行3R原则，IACUC编号：20160513024654。

1.2药物肤悦康洗剂（主要组成：苦参20 g、土槿皮20 g、广东紫荆皮10 g、芦荟5 g、石菖蒲5 g、麻黄5 g等）由中山市中医院制剂室提供；哈西奈德溶液（天津市天骄制药有限公司，CAS号：H12020342）。

1.3试剂与仪器DNCB（美国Sigma公司，CAS号：528-76-7）；丙酮（国药集团化学试剂有限公司，CAS：67-64-1）；硫化钠（国药集团化学试剂有限公司，CAS号：1313-84-4）；抗干扰素γ（IFN-γ）抗体（美国CST公司）；抗转化生长因子β1（TGF-β1）抗体（美国Abcam公司）；TRIzol Reagent（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒（美国Invitrogen公司）；中强度RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL发光液（杭州弗德生物科技有限公司）；5×蛋白上样缓冲液（武汉博士德有限公司）；脱脂奶粉（BD）、吐温-20（上海阿拉丁生化科技有限公司）。ST16高速离心机（美国Thermo Fisher公司）；DG5031多功能酶标仪（华东电子有限公司）；XMTD204水浴锅（常州智博仪器制造有限公司）；MF113W扫描仪（日本Canon公司）。

1.4分组、造模与给药将36只豚鼠随机分为正常组，模型组，哈西奈德组，肤悦康洗剂低、中、高剂量组，每组6只。按照文献[7]复制豚鼠湿疹模型。给予豚鼠20 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，应用80 g/L硫化钠溶液在豚鼠背部面积为4 cm×3 cm的区域内进行脱毛，使皮肤暴露。将50μL生理盐水涂抹于对照组已脱毛的区域。将丙酮与橄榄油以1∶4比例加入DNCB中混合制成50 g/L和5.0 g/L的DNCB丙酮溶液，将50μL 50 g/L DNCB丙酮溶液涂抹于模型组，哈西奈德组，肤悦康洗剂低、中、高剂量组的脱毛区。1周后进行治疗。正常组：100μL生理盐水涂抹于脱毛区，每周1次，连续3周。模型组：100μL 5.0 g/L DNCB丙酮溶液涂抹于脱毛区，每周1次，共3次；每天2次用生理盐水浸湿的布敷于豚鼠的脱毛区，15 min后将布拿掉。哈西奈德组：100μL 5.0 g/L DNCB丙酮溶液涂抹于脱毛区，每周1次，共3次；每天2次用浸泡过0.1%哈西奈德溶液的布外敷，15 min后拿掉湿布。肤悦康洗剂低、中、高剂量组：100μL 5.0 g/L DNCB丙酮溶液涂抹于脱毛区，每周1次，共3次；每天2次将浸泡过含有1.2、2.4、3.6 g/mL的肤悦康洗剂的布敷于豚鼠脱毛区，15 min后拿掉湿布。治疗21 d后，对伤口的红斑、水肿和抓痕进行评分，并收集背部皮肤组织用于分析。

1.5观察指标与方法

1.5.1 观察皮损情况及计算疗效指数 观察豚鼠红斑、水肿、抓痕等皮损情况，并计分。红斑：无，计0分；轻微，计1分；轻度红斑无结痂，计2分；中度红斑伴轻度至中度结痂，计3分；重度结痂伴明显的红斑，计4分。水肿：无，计0分；轻微，计1分；中等和严重，计2分。抓痕：无，计0分；有，计1分。疗效指数=（治疗前积分-治疗后积分）/治疗前积分×100%[6，7]。

1.5.2 定量聚合酶链反应（qPCR）法检测白细胞介素（IL）-2、IL-4、IL-17、IL-31、IFN-γ、TGF-β1 mRNA表达水平 抽提总RNA，定量，逆转录。各取2μL PCR上游引物和下游引物（具体信息见表1）、2μL模板DNA、0.4μL的50×荧光定量PCR参比染料和3.6μL双蒸水配成10μL的PCR反应体系，按照如下反应程序进行：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸35 s，进行40个循环后进行检测。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.5.3 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测豚鼠皮肤组织中IFN-γ和TGF-β1的蛋白水平 将豚鼠皮肤组织完全剪切后放入超声波细胞破碎仪中进行破碎，加入RIPA和PMSF裂解缓冲液。于4℃18 000 r/min离心60 min后弃去上清。将定量蛋白质与样品缓冲液以1∶1的比例混合，（100±4）℃煮10 min。通过10%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，其中，浓缩凝胶的电压为75 V，分离凝胶为120 V。之后将蛋白质转移到PVDF膜上。将膜用5%BSA封闭1 h，加入一抗（抗IFN-γ抗体/抗TGF-β1抗体，兔/小鼠，1∶1 000）4℃孵育过夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10 min，然后在室温下加入二抗孵育1 h。用TBST再次洗涤后，将膜放入暗箱中进行曝光，通过FluorChem M测定目的蛋白质的相对表达水平（p），内参为β-actin。

1.6统计方法采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（s）表示，多组比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1治疗21 d后各组豚鼠湿疹的皮损情况治疗21 d后，模型组表现出明显的湿疹反应，其特征为弥漫性红斑，边界不清，水肿，血痂及抓痕，背部出现粟粒状丘疹，类似于人类湿疹的临床表现；哈西奈德组背部有轻微红斑，水肿，少量抓痕和结痂的现象；肤悦康洗剂高剂量组与哈西奈德组显示出相似的治疗作用；肤悦康洗剂低、中剂量组治疗效果不明显。见图1。

2.2各组疗效指标比较图2结果显示：与正常组比较，模型组疗效指数降低（P＜0.05）。与模型组比较，肤悦康洗剂中、高剂量组和哈西奈德组疗效指数升高（P＜0.01或P＜0.001），且肤悦康洗剂的作用效果呈剂量依赖性。

2.3各组豚鼠皮肤组织IL-2、IL-4、IL-17、IL-31、IFN-γ、TGF-β1 mRNA表达比较图3结果显示：与正常组比较，模型组豚鼠皮肤组织IL-4、IL-17、IL-31、TGF-β1 mRNA表达水平升高（P＜0.05），IL-2、IFN-γmRNA表达水平显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，肤悦康洗剂低、中、高剂量组和哈西奈德组豚鼠皮肤组织IL-4、IL-17、IL-31、TGF-β1 mRNA表达水平降低（P＜0.001），IFN-γmRNA表达水平显著升高（P＜0.001），肤悦康洗剂高剂量组IL-2 mRNA表达水平升高（P＜0.001），且肤悦康洗剂的作用效果呈剂量依赖性。

2.4各组豚鼠皮肤组织IFN-γ、TGF-β1蛋白表达比较图4结果显示：与正常组比较，模型组豚鼠皮肤组织IFN-γ蛋白表达水平降低（P＜0.05），TGF-β1蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与模型组比较，肤悦康洗剂低、中、高剂量组及哈西奈德组皮肤组织IFN-γ蛋白表达水平升高（除肤悦康洗剂低剂量组，P＜0.01或P＜0.001），TGF-β1蛋白表达水平降低（P＜0.01或P＜0.001），且肤悦康洗剂的作用效果呈剂量依赖性。

图1 治疗21 d后各组豚鼠湿疹的皮损情况Figure 1 Comparison of the skin lesions of guinea pigs with eczema in various groups after 21-day treatment

图2 各组疗效指数比较Figure 2 Comparison of the curative efficacy index in various groups（s）

图3 各组皮肤组织IL-2、IL-4、IL-17、IL-31、IFN-γ、TGF-β1 mRNA表达比较Figure 3 Comparison of the mRNA expression levels of IL-2，IL-4，IL-17，IL-31，IFN-γand TGF-β1 in skin tissues of various groups（s，n=3）

图4 各组皮肤组织IFN-γ和TGF-β1蛋白表达比较Figure 4 Comparison of the mRNA expression levels of IFN-γand TGF-β1 in skin tissues of various groups（-x±s，n=3）

3 讨论

湿疹是一种过敏性皮肤病，病因复杂，其特征是反复发作，有明显瘙痒和多形性病变[8]。其病因主要是致敏物质的敏化特性和宿主对外源性过敏原的反应[9]。有证据表明，湿疹是一种与免疫调节障碍有关的疾病，湿疹患者的皮肤炎症因子表达量明显高于正常人，其中，CD4+T辅助T（Th）细胞在免疫疾病中发挥重要作用[10]。各种促炎细胞因子刺激抗原呈递细胞（APC），然后将初始T细胞极化 为Th1、Th2、Th17[11，12]。Th1细胞 分 泌IL-2、IFN-γ、TNF-β1及其他细胞因子[13，14]，Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等细胞因子[15，16]，主要介导体液免疫。近年来，有研究发现湿疹患者调节性T细胞功能下降或受损会减弱对Th2细胞的抑制作用，Th1/Th2漂移是湿疹发病和复发的主要机制[17]。近期的研究发现，Th17细胞及相关的细胞因子IL-17/IL-23参与了湿疹的发病，并且影响着疾病的严重程度，IL-31作为新发现的与皮肤慢性炎症和瘙痒相关的细胞因子，在特应性皮炎患者中的表达也有升高的趋势。TGF-β在细胞免疫调节方面有着重要的作用，能够抑制丝裂原、同种异体抗原刺激的免疫系统中T细胞的增殖[18-20]。

湿疹作为一种慢性皮肤病，在常规治疗中长期使用激素，这种治疗方法会产生一系列副作用[21，22]，如耐药性、皮肤角质层变薄、毛细血管扩张等。因此寻找一种疗效好而副作用少的治疗方法是目前治疗湿疹的新方向，肤悦康洗剂中含有许多具有免疫调节作用的中草药成分，从中医理论或现代免疫学来看，肤悦康洗剂具有很大的潜在功效[3]。

对豚鼠的耳朵反复涂抹DNCB已被证实是一种接触性湿疹的新动物模型[23]。本研究结果显示：治疗21 d后，肤悦康洗剂高剂量组可有效消除红斑、水肿和鳞屑，与哈西奈德组的结果相似。肤悦康洗剂低、中、高剂量和哈西奈德组疗效指数较模型组升高，且肤悦康洗剂的作用效果呈剂量依赖性。低、中、高剂量肤悦康洗剂可使湿疹模型豚鼠皮肤组织升高的IL-4、IL-17、IL-31和TGF-β1表达水平明显降低，使降低的IL-2、IFN-γ水平显著提高，且肤悦康洗剂的作用效果呈剂量依赖性。IFN-γ和TGF-β通常被认为是Th1和Th2的特征性细胞因子。这表明肤悦康洗剂可通过调节皮肤TGF-β和IFN-γ的水平来维持Th1/Th2细胞因子的动态平衡。

综上所述，肤悦康洗剂对豚鼠因DNCB引起的湿疹有良好的治疗作用，其机制可能与调控Th1/Th2的平衡有关。肤悦康洗剂能降低皮肤组织中IL-31的表达水平，缓解皮肤瘙痒引起的皮肤糜烂等问题，这为临床治疗湿疹提供了一种新的有效的方法。本研究就肤悦康洗剂对湿疹的治疗机制进行了探讨，同时对肤悦康洗剂治疗湿疹的用量范围进行了摸索。我们在今后的研究将继续探究肤悦康洗剂安全性方面的问题和治疗湿疹具体的用量问题。