抑制USP22基因对人结直肠癌细胞增殖的影响

王静，赵成诚，荣婉

（1.武汉生物工程学院 生命科学与技术学院，湖北 武汉 430415；2.武汉华联科生物技术有限公司，湖北 武汉 430212）

结肠直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全世界常见的胃肠肿瘤类型之一。据估计，2016年有134 490 例新发CRC 病例和49 190 例CRC 相关死亡病例[1]。手术切除、放化疗仍然是目前CRC 治疗的主要方式，化疗药物能够显著抑制CRC 进展[2-3]。但化疗药物的反复使用，易使肿瘤细胞产生耐药性，致使化疗方案最终失败。为此，研究CRC 的发病机制及新的治疗靶点，对开发新型的CRC 化疗药物，提高CRC 患者的生存率有重要的理论意义。

既往研究发现并确认与肿瘤转移和治疗预后相关的11 个癌症死亡标签[4-5]，泛素特异性肽酶22（ubiquitin-specifc protease 22, USP22）是其中之一。作为转录调控组蛋白乙酰化复合物SAGA 的组成部分，USP22 通过调控组蛋白的去泛素化来调节基因转录，发挥广泛的生物功能，包括细胞周期进程、胚胎发育及端粒稳态[6-7]。USP22 在人正常组织中广泛表达，但在恶性肿瘤如结直肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌及肺癌中表达量上升，与肿瘤发生、转移有关[8-10]，这些研究表明USP22 在肿瘤发生及发展中具有重要作用。然而，USP22 对结直肠癌具体调控机制不详。本研究采用特异性小干扰RNA（small interference RNA, siRNA）沉默结直肠癌细胞中USP22基因的表达，观察结直肠癌细胞的增殖、周期及凋亡的变化，同时检测相关蛋白的表达情况，以期初步阐明USP22 对结直肠癌细胞的生物学影响及可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及试剂 HCT-116、SW480、HT-29 购自中国科学院细胞库，结直肠癌组织芯片购自于武汉爱威尔生物科技有限公司，MTT、Annexin V-FITC/PI 试剂盒购自于北京碧云天生物技术研究所，胎牛血清（FBS）、IMDM、L15、DMEM 培养基购自美国Gibco 公司，硝酸纤维素膜、发光液购自武汉华联科生物技术有限公司，抗Cyclin B1 抗体、抗p21 抗体、抗CDK2 抗体、抗USP22 抗体、抗GAPDH 抗体、抗p53 抗体购自英国Abcam 公司，辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG 购自武汉博士德生物有限公司，其他常用生化试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器 二氧化碳CO2培养箱购自美国Thermo 公司，流式细胞仪购自美国BD 公司，电泳仪、电转移购自美国Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫荧光检测USP22 表达 组织芯片脱蜡后，高压抗原修复20 min；3% H2O2室温温育10 min，PBS漂洗，滴加USP22 抗体（1：20），4℃过夜；PBS 冲洗，Alexa Fluor 594 标记山羊抗兔IgG（1：200），37℃孵育1 h，PBS 冲洗，滴一滴抗荧光淬灭封片液（含DAPI），约20 μl；盖上盖玻片，荧光显微镜观察。

1.2.2 细胞培养及传代 HCT-116、SW480、HC-29分别利用McCOY's 5A、L15、McCOY's 5A 培养基（含10% FBS、100 u/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素）37℃、5% CO2培养。细胞黏合度达到90%以上时，弃去培养液，PBS 冲洗，0.25%胰蛋白酶消化，加培养液吹打均匀成单细胞悬液，按1：2 的比例传代培养。

1.2.3 Western blotting 检测结直肠癌细胞中USP22 表达 弃去培养基，用预冷PBS 洗2 次，加入RIPA 冰上 裂解20 min，收集细胞于离心管中，4℃ 12 000 r/min 离心10 min，收集上清液。将25 μg 提取的蛋白行SDS-PAGE 电泳，半干式电转至硝酸纤维素膜后，室温封闭1 h，兔抗USP22 抗体（1：1 000）4℃孵育过夜，加羊抗兔二抗（1：10 000）37℃孵育1 h。TBST 洗涤3 次。采用ECL 发光显影。并用Quantity One 软件对蛋白条带进行灰度分析。

1.2.4 Western blotting 检 测USP22 siRNA 干扰效率针对USP22（XM_005256575.2）设计特异性的靶序列（USP22 siRNA）5'-GCAGCTCACTATGAAGA AACT-3'；同时设置阴性对照序列（NC）5'-TTCTCC GAACGTGTCACGT-3'。将细胞分为对照组（未转染组），NC 组（转染NC 片段）和USP22 siRNA 组（转染USP22 siRNA 片段），利用Lipofectamine 2000 转染试剂盒转染SW480 结直肠癌细胞；24 h 后，收集细胞，RIPA 提取蛋白，通过Western blotting 检测USP22 表达情况。

1.2.5 细胞活力检测 将SW480 细胞分为3 组，分组方式同1.2.4，分别进行转染后，传于96 孔板，37℃、5% CO2分别培养12、24、48、72 及96 h，每组设置5 个复孔。利用MTT 检测试剂盒检测每孔光密度（OD）值。

1.2.6 细胞周期检测 将SW480 细胞分为3 组，分组方式同1.2.4，分别进行转染24 h 后收集细胞悬液，1 000 r/min 离心5 min，吸取上清液。PBS 重悬漂洗细胞，缓慢加入700 μl 预冷的乙醇，使乙醇终浓度为70%，4℃固定过夜，1 000 r/min 离心5 min，预冷PBS 漂洗2 次。加入100 μl RNaseA（50 μg/ml），37℃水浴30 min，加入400 μl PI（50 μg/ml），4℃避光染色30 min，流式细胞仪检测。

1.2.7 细胞凋亡检测 将SW480 细胞分为3 组，分组方式同1.2.4，分别转染24 h 后收集细胞，加入Annexin V-FITC 及PI 染色，随即进行流式细胞仪检测分析。

1.2.8 Western blotting检测 将SW480细胞分为3组，分组方式同1.2.4，分别转染24 h 后弃上清液，收集细胞，RIPA 裂解收集蛋白，以Cyclin B1（1：1 000）、p21（1：800）、CDK2（1：1 000）、p53（1：1 000）为一抗，通过Western blotting 检测各指标的表达。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织USP22 高表达

免疫荧光检测发现，在结直肠癌组织中，USP22异常高表达；配对的癌旁组织中，USP22 呈阴性。见图1。

2.2 结直肠癌细胞株USP22 表达情况

图1 结直肠癌组织和癌旁组织中USP22 表达 （×200）

Western blotting 检测发现，人结直肠癌细胞株HT-29、SW480、HCT-116 均表达USP22，HT-29、HCT-116和SW480 细胞中USP22 相对表达量（相对GAPDH）分别为（0.61±0.03）、（0.73±0.04）和（0.85±0.06）。各组细胞USP22 表达有差异（F=69.130，P=0.000）；与HT-29 细胞、HCT-116 细胞比较，SW480 细胞中USP22 表达量最高（P＜0.05），因此选择SW480 细胞作为后续研究。见图2。

2.3 USP22 siRNA 降低USP22 的表达

USP22 siRNA 转染SW480 细胞，作用24h 后检测USP22 的表达量。对照组、NC 组及USP22 siRNA 组USP22 相对表达量（相对GAPDH）分别为（0.98± 0.15）、（0.94±0.22）和（0.30±0.02），差异有统计学意义（F=200.600，P=0.000）。USP22 siRNA 组与对照 组比较，USP22 siRNA 可降低USP22 的表达量（P＜0.05）。见图3。

2.4 USP22 抑制后细胞增殖能力情况

对照组、NC 组、USP22 siRNA 组在12、24、48、72 及96h 的OD 值比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的OD 值有差异（F=315.312，P=0.000）；②3 组在相同时间段的OD 值有差异（F=716.226，P=0.000）；③3 组OD 值变化趋势有差异（F=37.270，P=0.000）。见表1。

图2 3 种细胞株中USP22 蛋白表达情况

2.5 USP22 抑制后细胞周期的变化情况

流式细胞术检测结果显示：对照组、NC 组及USP22 siRNA 组G0/G1期细胞占比分别为（43.16± 0.64）%、（45.35±0.85）%和（67.94±2.03）%，差异有统计学意义（F=322.800，P=0.000），USP22 干扰后，G0/G1期细胞占比较对照组升高（P＜0.05）；对照组、NC 组及USP22 siRNA 组S 期细胞占比分别为（38.54±1.05）%、（37.23±1.90）%和（16.36±0.75）%，差异有统计学意义（F=2628.000，P=0.000），USP22干扰后，S 期细胞占比较对照组降低（P＜0.05）。见图4。

图3 3 组USP22 的表达情况

2.6 USP22 抑制后细胞凋亡率的变化情况

细胞凋亡结果显示，对照组、NC 组和USP22 siRNA 组早期凋亡细胞率分别为（6.59±0.11）%、（8.73± 0.14）%和（21.18±0.25）%，3 组凋亡率比较差异有统计学意义（F=492.800，P=0.000）。与对照组比较，USP22 siRNA 增加细胞早期凋亡率（P＜0.05）。见图5。

表1 各组细胞在不同时间条件下OD 值的变化 （±s）

表1 各组细胞在不同时间条件下OD 值的变化 （±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与12 h 比较，P ＜0.05。

组别 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h对照组 0.41±0.02 0.67±0.01② 0.79±0.06② 0.95±0.04② 1.24±0.05②NC 组 0.41±0.01 0.63±0.03② 0.74±0.06② 0.84±0.02② 1.07±0.07②USP22 siRNA 组 0.41±0.02 0.43±0.01①② 0.48±0.03①② 0.56±0.06①② 0.65±0.04①②

图4 USP22 抑制后SW480 细胞周期的变化情况

2.7 USP22 抑制后周期相关蛋白的表达情况

对照组、NC 组和USP22 siRNA 组中周期蛋白 CyclinB1、CDK2 的表达有差异（F=377.346 和211.132，P=0.000），USP22 siRNA 组中CyclinB1、CDK2 的表达量较对照组降低（P＜0.05）；3 组p21 和p53 的表达量有差异（F=168.414 和392.018，均P=0.000），USP22 siRNA 组中p21、p53 的表达量较对照组升高（P＜0.05）。见表2和图6。

图5 USP22 抑制后SW480 细胞凋亡率的变化情况

表2 3 组周期相关蛋白相对表达量比较 （±s）

表2 3 组周期相关蛋白相对表达量比较 （±s）

注：†与对照组比较，P ＜0.05。

组别 CyclinB1 CDK2 p21 p53对照组 0.77±0.08 0.86±0.02 0.25±0.01 0.45±0.02 NC 组 0.75±0.08 0.84±0.04 0.26±0.02 0.48±0.03 USP22 siRNA 组 0.30±0.03† 0.43±0.09† 0.62±0.07† 0.91±0.09†F 值 377.346 211.132 168.414 392.018 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

图6 USP22 抑制后，周期蛋白表达

3 讨论

2005年，GLINSKY 等[11]对各种肿瘤组织的mRNA 水平进行分析，发现肿瘤组织中的11 个过表达的基因可以用作癌症死亡标志基因，包括USP22、BUB1、HEC1/KNTC2、CCNB1、Ki67、Gbx2、FGFR2、ANK3、CES、BMI-1和RNF2。USP22 过表达可能与肿瘤发生、转移、复发和耐药性相关。有研究认为，利用慢病毒载体sh-USP22 能有效抑制USP22基因的表达，并有效抑制鼻咽癌CNE-2 细胞的裸鼠成瘤能力[12]。张琳等[13]研究认为，结直肠癌组织中USP22 的异常高表达可能参与结直肠癌的发生、发展过程。USP22 表达与胰腺癌细胞系对吉西他滨敏感性相关，抑制USP22 表达增加胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性，可有效逆转吉西他滨的耐药[14]。本研究发现，HT-29、HCT-116、SW480 3 株结直肠癌细胞中均有USP22 表达，其中SW480 的表达量最高。

USP22 在细胞周期调控过程中起到重要作用。hSAGA 是转录辅助因子复合物，其通过组氨酸尾部的特异性氨基酸共价修饰（例如乙酰化、甲基化和去泛素化）将其转录复合物募集到其靶基因的启动子以激活基因转录[15-16]。USP22 是hSAGA 的亚单位，可以引起组蛋白H2A 和H2B 的去泛素化和组蛋白H4 的乙酰化[17]。本研究使用RNAi 的方法探索抑制USP22对于结直肠癌细胞增殖的影响，结果发现USP22 表达量的减少可以增加G0/G1期的细胞比例，使结直肠癌细胞周期停滞在G0/G1期，从而抑制细胞的周期进程。此外，促进细胞周期进程[18]相关的CyclinB1、CDK2 蛋白的表达量也降低，而细胞周期负性调控因子p21[19]的表达量升高。p21 的表达量与细胞凋亡同样密切相关，本研究也发现USP22 被抑制后可以增加结直肠癌细胞的凋亡比例，说明USP22 可以影响结直肠癌细胞的凋亡。

综上所述，USP22 抑制后，能够抑制结直肠癌细胞的增殖，其机制可能与抑制细胞周期进程，促进细胞凋亡有关。本研究结果可以为筛选USP22 作为治疗结直肠癌的靶标提供理论依据，但具体的作用机制以及相关通路需要更进一步的研究。