藜麦GRF转录因子家族的鉴定及表达分析

时丕彪 何 冰 费月跃 王 军 王伟义 魏福友 吕远大 顾闽峰,*

藜麦GRF转录因子家族的鉴定及表达分析

时丕彪1何 冰2费月跃1王 军1王伟义1魏福友1吕远大2顾闽峰1,*

1盐城市新洋农业试验站, 江苏盐城 224049;2江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所, 江苏南京 210014

生长调控因子(growth-regulating factor, GRF)是植物特有的一类转录因子, 对植物的生长发育起重要的调控作用。藜麦是一种单体植物即可满足人体基本营养需求的食物, 也是未来最具潜力的农作物之一。但是关于藜麦GRF基因家族的研究至今尚缺乏报道。因此, 本研究利用生物信息学方法, 对藜麦GRF基因进行全基因组鉴定, 并对其理化性质、基因结构、保守结构域、系统发育关系及组织表达进行分析。结果表明, 藜麦中共有18个GRF转录因子, 蛋白长度77~621 aa, 分子量8.81~67.38 kD, 等电点5.23~9.37; 每个成员含有1~4个内含子及2~5个外显子, 这些GRF蛋白都具有由31~35个氨基酸组成的QLQ保守结构域或由25~43个氨基酸组成的WRC保守结构域。系统进化分析表明, 藜麦与拟南芥的GRF转录因子亲缘关系比水稻更近。表达图谱显示, 藜麦GRF基因具有明显的组织表达特异性, 总体在种子中的表达量较高, 其次是在花序和根中, 在其他组织中的表达量相对较低。

藜麦; GRF转录因子; 进化分析; 表达分析

转录因子是植物中最重要的一类调节基因, 参与植物生长、发育、代谢、繁殖、分化等多种生物学过程[1-3]。目前在植物中已发现60多个转录因子家族[4], 其中生长调控因子(growth-regulating factor, GRF)是植物特有的一类蛋白, 对植物的生长发育起重要的调控作用[5-7]。GRF转录因子在N端区域含有QLQ和WRC两个保守结构域[8-9], QLQ结构域与GRF互作因子GIF (GRF interacting factors)相互作用形成转录激活因子[10], WRC结构域包含一个功能核定位信号NLS (nuclear localization signal)区域和一个与DNA结合的锌指基序[8], 均与GRF转录因子发挥生物学功能密切相关。

在水稻中首次发现了GRF基因, 该基因能够调控赤霉素诱导的水稻茎的伸长[11]。近年来, 随着基因组测序的完成, 越来越多物种中的GRF基因被鉴定和研究[12], 其中, 双子叶模式植物拟南芥中共有9个GRF成员[8], 单子叶植物模式植物水稻中共有12个GRF成员[13]。相关研究表明, 这些GRF基因在生长发育活跃的组织中表达水平较高, 如茎尖、花芽、未成熟的叶片等, 但在成熟的组织或器官中表达量相对较低, 其中多种GRF基因参与了叶片原基细胞增殖的调控和茎尖分生组织器官的分离[14-19]。在拟南芥[20-21]和毛果杨[22]中发现GRF基因对花的发育起重要的调控作用; 有些GRF基因还参与拟南芥雌性生殖器官的发育和胚珠的形成[23],说明它们可能与种子的发育有关。在油菜中,基因能通过调控细胞数目和光合作用来增加油菜籽产油量[24]。

GRF蛋白主要是通过与GIF互作形成蛋白复合体参与这些生物学过程[25-28], 而GRF的功能有时又会受miR396的调控, 比如拟南芥中有7个基因是miR396的靶基因, 其表达受到miR396的调控, 进而对拟南芥根、茎、叶的生长发育产生影响[14]。GRF的表达量越高, 并不是越利于植物的生长发育, 如水稻过量表达引起植株多种生理缺陷, 包括叶片卷曲、开花延迟和心皮发育不完善[11]; 玉米过表达虽能增加叶片大小, 但降低了玉米可育性[29],过表达减小了叶片面积[30]; 拟南芥超表达植株的叶片生长受到明显抑制[31]。

藜麦(Willd.)是一种全营养谷物, 富含人体必需的9种氨基酸[32], 被联合国粮农组织(FAO)认定为一种单体植物即可满足人体基本营养需求的食物[33], 并且藜麦对多种非生物胁迫如盐碱、干旱、霜冻等具有一定的耐受性[34-36]。因此, 藜麦已引起了研究人员和消费者的广泛关注。2017年公布了藜麦高质量参考基因组, 促进了藜麦功能基因组学的研究[37]。本研究利用生物信息学手段, 以拟南芥GRF基因家族成员的蛋白质序列为参考, 在藜麦基因组数据库通过BlastP序列比对, 获得藜麦GRF转录因子家族全部成员, 并对其理化性质、基因结构、保守结构域和系统发育关系以及根据RNA-seq数据对藜麦GRF基因在不同组织的表达模式进行分析, 旨在为进一步研究藜麦GRF转录因子的功能及GRF影响植物生长发育的调控机制提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 基因组数据和转录组数据的来源

藜麦全基因组数据从Phytozome v12 (http:// phytozome.jgi.doe.gov/pz/)中的v1.0获得、转录组数据从NCBI获得, 拟南芥GRF蛋白序列下载于拟南芥全基因组数据库TAIR (https://www.arabidopsis.org/),水稻GRF蛋白序列下载于水稻全基因组数据库(http://rapdb.dna.affrc. go.jp/)。

1.2 藜麦GRF基因家族成员的鉴定及分析

从拟南芥数据库获取基因家族成员的蛋白序列, 并以此为查询对象在藜麦基因组数据库进行Blastp比对, 设E值为10-5, 将得到的藜麦蛋白序列在Pfam (http://pfam.xfam.org/)和CDD (https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)上检测其结构域, 去除没有QLQ或WRC结构域的蛋白序列。

将获取的藜麦GRF基因的氨基酸序列输入ExPasy网站(http://au.expasy.org/tool.html), 采用Compute pI/MW工具分析, 得到GRF蛋白的多种理化性质, 包括氨基酸长度、分子量、等电点等。

1.3 系统进化树的构建

利用ClustalW对藜麦、拟南芥、水稻GRF的氨基酸序列进行多重比对, 使用MEGA 5.05软件及邻接法(Neighbor-Joining, NJ)(bootstrap = 1000)构建无根进化树。

1.4 藜麦GRF基因结构分析

根据藜麦GRF基因家族成员的基因组DNA序列及CDS序列, 利用GSDS 2.0 (http://gsds.cbi.pku. edu.cn/)分析其基因结构。

1.5 藜麦GRF家族成员保守结构域分析

在Pfam分析得到藜麦GRF转录因子保守结构域的氨基酸序列起始位置, 利用IBS 1.0绘制结构域位置图, 并利用ClustalX 2.0软件对结构域氨基酸序列进行比对。

1.6 藜麦GRF基因的组织表达分析

从NCBI下载藜麦生长发育过程中各组织器官的RNA-Seq数据, 包括苗龄为6周的藜麦植株的根、茎、叶片、花序和幼苗以及0周龄的成熟干种子, 以此来分析藜麦GRF基因的表达情况。对各成员的表达量取log2TPM, 然后用R绘制藜麦GRF基因家族的组织表达热图。

1.7 基因的荧光定量表达分析

采用实时荧光定量PCR进一步确定从表达图谱中筛选出来的组织表达特异性较为明显的6个GRF基因的表达模式, 所取样品与RNA-Seq所选样品一致。使用TIANGEN试剂盒提取RNA, 用Takara的反转录试剂盒合成cDNA第1条链, 以各样品的cDNA为模板, 浓度统一稀释为100 ng µL-1, 进行定量PCR扩增,为内参基因[38], 各基因特异引物序列见表1。反应体系为20 µL, 包含10 µL SYBR green supermix、5.5 µL ddH2O、正反向引物各1 µL、2.5 µL cDNA。反应条件为95℃预变性10 min; 95℃变性10 s, 60℃退火30 s, 40个循环。采用2–ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 藜麦GRF基因家族成员的鉴定及分析

把拟南芥GRF蛋白序列在藜麦数据库进行Blastp比对, 对所获得的蛋白序列在Pfam数据库进行结构域分析, 筛选出具有QLQ或WRC保守结构域的蛋白序列, 最终鉴定出18个藜麦GRF候选基因(表2)。

利用ExPasy对藜麦GRF基因的理化性质分析表明, 不同GRF转录因子的蛋白序列存在较大差异, 氨基酸长度77~621 aa, 蛋白分子量8.81~67.38 kDa, 其中均以AUR62007538最大, AUR62009885最小。等电点以AUR62013612最大, 为9.37, AUR62006018最小, 为5.23; 其中等电点小于7的GRF蛋白有6个, 偏酸性; 其余的12个GRF蛋白等电点均大于7, 偏碱性。

表1 定量PCR引物序列

表2 藜麦GRF基因家族成员基本信息

(续表2)

aa: 氨基酸; MW: 分子量; pI: 等电点。

aa: amino acid; MW: molecular weight; pI: isoelectric point.

2.2 藜麦GRF基因家族系统发育关系分析

为了更好地了解藜麦GRF基因家族的系统发育关系, 将藜麦(18个GRF基因)、拟南芥(9个GRF基因)和水稻(12个GRF基因)的GRF蛋白序列进行多重比对, 构建无根进化树(图1)。根据进化树分支, 将39个GRF转录因子划分为Class I、II、III、IV四类, 其中Class I和Class IV均有6个藜麦GRF基因, Class II有4个藜麦GRF基因, Class III存在2个藜麦GRF基因。Class III和Class IV只有藜麦和拟南芥GRF分布, 不存在水稻GRF基因, 并且在其他两类中表现出拟南芥与藜麦GRF进化关系相对较近一些, 说明藜麦与拟南芥的GRF转录因子亲缘关系比水稻更近。Class III只有3个基因、和, 说明这2个藜麦GRF基因与拟南芥具有较高的同源性, 在功能上可能也具有相似性。

图1 藜麦、拟南芥和水稻GRF基因家族系统进化树

2.3 藜麦GRF基因结构分析

如图2所示, 不同GRF基因的结构存在一定的差异, 除、和具有2个外显子和1个内含子外, 其他成员均含有2~4个内含子及3~5个外显子; 根据目前藜麦基因组注释检测到, 6个GRF基因同时具有5¢-UTR(非翻译区)和3¢-UTR, 4个GRF基因只含有3¢-UTR, 其余8个GRF基因没有非翻译区。

图2 藜麦GRF基因家族进化树与基因结构

18个GRF基因形成了8个旁系同源基因, 同源基因的结构具有一定的相似性(图2)。如和为一对同源基因, 都含有3个外显子和2个内含子, 基因长度也相似;和为一对同源基因, 均具有4个外显子、3个内含子、5¢-UTR及3¢-UTR, 但第2个内含子长度差异较大。

2.4 藜麦GRF基因家族保守结构域分析

藜麦GRF转录因子蛋白序列在Pfam上分析结果显示, 18个GRF蛋白均含有QLQ或WRC结构域, 并且两结构域均位于蛋白的N端(图3)。其中, AUR62009885、AUR62025191、AUR62028983和AUR62006018只具有QLQ结构域, AUR62035608、AUR62019933、AUR62004236和AUR62013612只具有WRC结构域, 其他10个GRF转录因子同时具有QLQ和WRC结构域。从图3可以看出, 藜麦GRF同源基因对的蛋白长度及结构域位置有很高的相似性。

为了进一步分析藜麦GRF转录因子QLQ和WRC结构域的保守性, 对2个结构域的氨基酸序列进行多重比对, 发现QLQ结构域由31~35个氨基酸组成, WRC结构域由25~43个氨基酸组成, 并且两结构域中均有多个氨基酸位点是保守不变的(图4)。QLQ结构域的氨基酸序列为QX3LX2Q; WRC结构域含有一个跨越3个半胱氨酸C和1个组氨酸H的C3H模体, 其氨基酸序列为CX9CX10CX2H; 在藜麦中, WRC结构域的保守性比QLQ结构域更高一些。QLQ和WRC结构域中这些氨基酸保守区域可能通过与其他因子相互结合或相互作用, 从而影响藜麦GRF转录因子的激活与抑制。

2.5 藜麦GRF基因家族的组织表达分析

为初步分析藜麦GRF基因的功能, 利用RNA-Seq转录组数据对18个GRF基因在6个不同组织器官的表达情况进行分析, 包括6周龄的根、茎、叶片、花序和幼苗以及0周龄的成熟干种子。结果表明, 不同GRF基因在藜麦不同组织器官中的表达量存在明显差异(图5)。除在种子中不表达外, 其他GRF基因均在种子中有较高的表达量, 说明这些基因可能与藜麦种子的发育有重要关系; 各GRF基因在花序中均有表达, 表明它们可能在花序的发育过程中起着重要作用; 有9个GRF基因在根中不表达, 说明它们可能没有参与藜麦根系的发育过程; 所有GRF基因在叶片中均不表达, 可能是因为GRF基因与藜麦叶片的发育关系不大; 除和外, 其他GRF基因均在茎中不表达, 说明这2个基因可能参与了藜麦茎的发育过程; 只有、、和在幼苗中有一定的表达量, 它们可能调控着藜麦幼苗的生长。综上所述, 藜麦GRF基因具有明显的组织表达特异性, 在种子中的表达量相对较高, 其次是花序和根, 在其他组织中的表达量相对较低, 揭示它们在藜麦不同组织中可能具有不同的生物学功能。

图3 藜麦GRF蛋白保守结构域分析

图4 藜麦GRF蛋白QLQ (A)和WRC (B)结构域的氨基酸序列比对

为了进一步确定GRF基因在藜麦不同组织器官中具有明显的表达特异性, 从表达图谱中挑选6个GRF基因并对其进行实时荧光定量PCR分析以确定其相应的表达模式。由图6可知,在种子中的表达量显著高于其他组织, 其次是花序, 在根、茎、叶和幼苗中几乎不表达;和有着相同的组织表达模式, 在种子中的表达量相对较高, 其次是幼苗和花序, 在根、茎、叶中的表达量相对较低;和有着相似的组织表达模式, 在根中的表达量最高, 其次是幼苗, 在其他组织中表达量相对较低甚至不表达;在花序中的表达量最高, 其次是根和幼苗但表达量均相对较低, 在茎、叶和种子中几乎不表达。定量PCR分析结果与上述表达图谱结果基本一致。

图5 GRF基因在藜麦不同组织中的表达模式分析

(图6)

3 讨论

随着基因组测序技术的逐渐完善和分子生物学研究的不断深入, 大量植物全基因组测序已经完成并陆续公布了其基因组数据库, 这为鉴定植物基因家族、挖掘功能基因及研究基因功能等提供了极为有利的条件。GRF转录因子是植物特有的一类转录因子, 在植物的生长发育过程中发挥着重要的调控作用。目前, GRF基因家族在拟南芥[8]、玉米[39]、水稻[13]、番茄[40]、大白菜[5]、大豆[41]等多种植物中已有研究。藜麦作为未来最具潜力的农作物之一, 富含极高的营养价值, 但关于其GRF基因家族的研究至今仍缺乏报道。关于模式植物拟南芥和水稻GRF基因功能的研究较为深入。基因通过调控叶绿体的分裂来增加叶片面积和叶绿素含量, 从而增强植物的光合作用以促进植物生长发育[42];是多种渗透胁迫响应基因的抑制因子, 通过与脱水反应元件结合蛋白的启动子区域结合, 从而抑制该基因及其下游一系列渗透应激反应基因的表达, 可在正常生长条件下防止植物生长抑制[43]。过表达、、、的转基因水稻植株均增强稻瘟病的抗性, 但各自生长变化不同,过表达导致植株生长缺陷, 而、、过表达则导致水稻产量性状发生较好变化[44]。研究表明,能够调控2种细胞分裂素脱氢酶前体基因和的表达, 导致细胞分裂素水平升高, 从而增加穗长度, 此外,过量表达可增加籽粒硬度[45],与、互作, 从而调控水稻籽粒大小[46], 对水稻高产育种和机械化收获具有重要意义。

本研究利用生物信息学手段, 从藜麦全基因组数据库中共鉴定出18个GRF基因家族成员, 比拟南芥(9个)和水稻(12个)成员数目更多, 这可能是由于异源四倍体植物藜麦在进化过程中发生了全基因组复制和串联复制而导致GRF基因数目增加[47], 基因扩张同时也增强了藜麦对外界复杂多变环境的适应能力。藜麦GRF转录因子的蛋白长度、分子量、等电点等基本特性存在较大差异; 由于内含子的不断插入使其基因结构也发生一定程度的变化, 每个成员含有1~4个内含子和2~5个外显子, 部分GRF基因含有非翻译区。氨基酸序列分析表明, 大部分成员同时具有QLQ和WRC两个保守结构域, 少部分成员只具有其中一种结构域, 其中, QLQ结构域的基序为QX3LX2Q, WRC结构域的基序为CX9CX10CX2H, WRC结构域的保守性比QLQ结构域更高; QLQ和WRC结构域中这些氨基酸保守区域可能通过与其他因子相互结合或相互作用, 从而影响藜麦GRF蛋白的转录激活与抑制。对藜麦、拟南芥与水稻GRF基因家族构建系统进化树, 可将其分为4个亚家族, 其中藜麦和拟南芥的GRF广泛分布于每个亚家族, 水稻的GRF基因只存在于Class I和Class II, 表明GRF基因的进化在双子叶植物和单子叶植物中存在差异, 藜麦与拟南芥GRF转录因子的亲缘关系比水稻更为密切。

藜麦GRF基因主要在特定的组织和器官中表达, 可能在这些组织或器官的生长发育中发挥着重要的作用。本研究发现,、、、和在藜麦种子中的表达量均显著高于其他检测组织, 说明这些基因主要参与了藜麦种子的生长发育, 因此, 提高这些基因的表达水平可能有利于增加藜麦的产量。同源性越高的基因, 其功能越相似。例如,与拟南芥花的发育有关[48],和均与的同源性较高, 2个基因在藜麦花序中的表达量又相对较高, 说明和可能参与了藜麦花序的发育过程。水稻的基因与籽粒大小和籽粒硬度有关[45-46],其在藜麦中同源性较高的基因为和, 二者在种子中的表达量均显著高于其他组织, 说明这2个基因可能与藜麦产量性状有关。在后续的研究中还需要利用转基因技术或基因沉默技术对这些基因的功能和作用机制进一步验证。

4 结论

通过对藜麦GRF转录因子家族全基因组鉴定, 共获得18个成员, 分属4个不同亚家族, 具有典型的QLQ或WRC保守结构域, 基因表达具有明显的组织表达特异性, 在种子和花序中表达量较高, 与藜麦籽实产量紧密相关。

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Identification and expression analysis of GRF transcription factor family of

SHI Pi-Biao1, HE Bing2, FEI Yue-Yue1, WANG Jun1, WANG Wei-Yi1, WEI Fu-You1, LYU Yuan-Da2, and GU Min-Feng1,*

1Xinyang Agricultural Experiment Station of Yancheng City, Yancheng 224049, Jiangsu, China;2Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu, China

Growth-regulating factors (GRFs) are plant-specific proteins which play an important role in regulating plant growth and development. Quinoa is one of the plant sources that can meet human daily nutritional needs and is also considered as one of the most promising crops in the future. However, no systematical study about GRF gene family has been performed in quinoa to date. In this study, the GRFs in the whole genome of quinoa were identified by bioinformatics method, and their physicochemical properties, gene structure, conserved domain, phylogenetic relationship and tissue expression were analyzed. There were 18 GRF transcription factors in quinoa, with the protein length from 77 to 621 aa, the molecular weight from 8.81 to 67.38 kD and the isoelectric point from 5.23 to 9.37. Each member contained 1–4 introns and 2–5 exons. And all 18 GRF proteins possessed highly conserved QLQ domain composed of 31–35 aa or WRC domain composed of 25–43 aa. Phylogenetic analysis showed that the GRF transcription factors were more closely related between quinoa andthan between quinoa and rice. The expression level of GRFs was higher in seed, moderate in inflorescence and root, and relatively lower in other tissues, showing obvious tissue expression specificity.

; GRF transcription factor; phylogenetic analysis; expression analysis

本研究由江苏现代农业(蔬菜)产业技术体系(盐城)推广示范基地项目(JATS(2018)137)和江苏省农业科学院探索性颠覆性创新计划项目(ZX(17)2015)资助。

This study was supported by the Promotion Demonstration Base Program (Yancheng) of Jiangsu Modern Agriculture (Vegetable) Industry Technology System (JATS(2018)137) and Exploratory and Disruptive Innovation Program of Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (ZX(17)2015).

顾闽峰, E-mail: ycgmf@126.com

E-mail: 1032175660@qq.com

2019-03-22;

2019-06-22;

2019-07-13.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190712.0844.002.html

10.3724/SP.J.1006.2019.94049