PTPN9表达水平与结直肠癌的临床关系研究

夏天一 张博淼 姚克非 崔滨滨

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率在所有恶性肿瘤中分别位居第3位和第4位，且呈逐年递增趋势[1]，但大部分患者初次诊断结直肠癌时，病情已经发展至中期或晚期，导致患者预后较差。传统意义上的手术治疗与化学治疗取得了一定突破，但效果尚不十分理想，患者生存期仍较短，所以我们将目光聚焦于新作用靶点的发现。

经学者们研究发现，蛋白质的酪氨酸残基(Tyrosine residues，TYR)的磷酸化和去磷酸化可以调节细胞信号的转导，进而影响肿瘤的发生进展[2]。该过程是由蛋白酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinase，PTK)和蛋白质酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase，PTP)共同完成的。非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶9(Protein tyrosine phosphatase non-receptor type 9，PTPN9)是蛋白质酪氨酸磷酸酶亚家族的成员之一，在1993年科学家于巨核细胞中发现[3]，又称PTP-MEG2。近年来的研究表明PTPN9是miRNA-126的靶基因，可以通过干预磷酸肌醇通路或血管内皮生长因子，从而介导肿瘤的生长侵袭[4]。在现有研究中，学者们发现PTPN9与多种癌症有关，例如食管鳞癌、肝细胞癌、乳腺癌等[4-6]。本研究旨在探索PTPN9表达水平与各项临床参数的关系，进而评价其对于结直肠癌的影响。

1 资料和方法

1.1 肿瘤标本和临床参数

收集2007年12月—2008年12月哈医大附属肿瘤医院所行根治性手术治疗的146例结直肠癌患者肿瘤组织，肿瘤组织经福尔马林固定，石蜡包埋标本，随机选取蜡块，其中132例肿瘤组织，14例非肿瘤组织。病理学诊断依照第8版AJCC。所有患者随访至2017年12月。收集患者的临床指标，包括年龄、性别、肿瘤部位、病理学分级、肿瘤最大径、大体类型、分化程度、糖尿病患病情况、生存率。

1.2 免疫组化

将蜡块切成4 μM在60℃烤箱中烘烤120 min，后用二甲苯脱蜡3次，每次10 min；再置于无水酒精中水化，浓度95%、85%、75%各5 min；将切片用PBS液洗涤3次，每次3 min，后置于3%过氧化氢中室温下避光孵育8～10 min；然后EDTA缓冲液微波高温抗原修复。加山羊血清封闭液，室温下孵育15～20 min；滴加PTPN9一抗(1∶150)，4度湿盒过夜；次日，PBS液洗涤4次，每次5 min，滴加生物素标记二抗工作液，孵育15～20 min；PBS液洗涤4次，每次5 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃下孵育15～20 min；PBS液冲洗4次，每次5 min。DAB显色，苏木精复染3～5 min，脱水，透明，干燥，中性树胶封片。

1.3 结果判定

以细胞中出现棕黄色颗粒为阳性标记结果，按染色强度计分：0分为无色；1分为着色淡者；2分为着色适中者；3分为着色深者；阳性细胞占计数细胞的百分比计分：0分为<5%，1分为6%～25%，2分为26%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%。将每一张片子的染色强度与染色细胞百分数相乘，其评分为最后得分。0～2分为阴性(-)，3～5分为弱阳性(+)，6～9分为中等阳性(++)，>9分为强阳性(+++)。在统计分析中，将表达(-/+)划分为低表达组，将表达(++/+++)划分为高表达组。该结果由两位高年资病理医生进行双盲评分。

1.4 随访

自手术之日开始随访，采用电话等方式，随访截止日期为2017年12月，总生存期(Overall survival，OS)定义为手术之日到患者因任何原因死亡或截止日期的时间。

1.5 数据分析

运用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，应用卡方检验和Fisher确切概率法分析PTPN9表达水平与临床病理资料的关系，应用Kaplan-Meier曲线进行生存分析，用Cox比例风险模型进行多因素生存分析。所有检验均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTPN9的表达水平

PTPN9蛋白在结直肠癌组织细胞中均有表达，其主要出现在细胞质中，未于细胞核中发现阳性表达(图1)。在肿瘤组织中，PTPN9阳性表达为50.8%，非肿瘤组织阳性表达为14.3%，差异有统计学意义(P=0.009)。

图1 PTPN9在结直肠癌细胞中的表达情况Figure 1 Expression of PTPN9 protein in colorectal cancer tissuesNote：A.Magnification(×100)；B.Magnification(×200).

2.2 PTPN9的表达水平与临床病理资料

分析132例结直肠癌患者组织标本，发现PTPN9的表达水平与患者肿瘤病理学分期(P=0.008)和糖尿病患病(P=0.022)等指标有关，而PTPN9的表达水平与患者性别、肿瘤部位、肿瘤最大径、肿瘤大体类型、肿瘤分化程度等临床指标无关(P>0.05)(表1)。

表1 PTPN9表达评分与临床病理参数的关系

2.3 PTPN9的表达水平与总体生存期

生存分析评估PTPN9对于患者预后的影响，观察其表达水平变化所导致的总生存期差异。所有患者的随访时间从接受手术治疗开始至死亡或失访，时间截止至2017年12月，同时应用Kaplan-Meier曲线对数据分析发现高表达的PTPN9组患者其总生存期要明显短于低表达组(P<0.001)(图2)。通过应用多因素Cox回归分析发现PTPN9蛋白表达(HR=1.202，P<0.001)、T分期(HR=1.725，P<0.001)、N分期(HR=1.327，P=0.001)、M分期(HR=1.753，P=0.005)指标均具有统计学意义，为结直肠癌患者的独立预后指标，而肿瘤病理学分期(HR=1.276，P>0.05)、糖尿病(HR=1.060，P>0.05)为危险因素，但无统计学意义(表2)。

图2 PTPN9表达强度的Kaplan-Meier曲线Figure 2 Kaplan-Meier curve of PTPN9 expression intensity

表2 结直肠癌患者总生存期影响因素的多因素Cox回归分析

3 讨论

结直肠癌现为全球性高发肿瘤，但以手术和化疗为主的综合治疗对患者的生存期并未起到显著的效果。对于新的治疗靶点的发现可以让我们对结直肠癌的早期诊断，以及后续治疗打开新的思路，进而让患者群体得到充分的受益。关于PTPN9在其他多种癌症中已经有了相关的报道，而对于结直肠癌方面的作用尚处于空白阶段。在其他癌种中，学者们已发现PTPN9可以作为对患者生存期预测的独立预后因素，而本研究结果同样显示在肿瘤实体部位的PTPN9表达水平要高于癌旁组织，而PTPN9的表达水平与患者N分期、M分期、肿瘤病理学阶段、糖尿病、生存期等临床参数有着显著关联，提示PTPN9的表达水平与肿瘤病理学分期呈现正相关，同时高表达者有着较短的生存期。上述结论指出PTPN9的表达水平对于结直肠癌患者的预后是独立的预测因素。

根据以往的研究，我们可以发现PTPN9的功能在多种癌症中均有研究。在肝细胞癌中，Hu等[5]的研究表明PTPN9在肿瘤组织上的表达降低，PTPN9低表达患者具有较短的生存期，相比于高表达的患者。在Hong等[6]的研究中，PTPN9在乳腺癌组织中表达水平降低，且其表达可以降低肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。在Zhu等[4]的实验中，PTPN9在肿瘤组织中呈现高表达，标志着高期别的食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)。

既往研究中，学者们发现PTPN9具有肿瘤抑制功能[7]，可在上述癌种中PTPN9的功能却表现出一定差异性。研究发现PTPN9可以直接调节p-STAT所介导的去磷酸化作用，进而干预JAK/STAT通路所引起的持续刺激肿瘤发生侵袭的作用，而其核心在于PTPN9的表达干预STAT3的活化[8]。回顾上述研究，归纳来看在不同癌症中：(1)PTPN9的低表达可以引发STAT3的激活，从而增强肿瘤的侵袭能力[5]；(2)miR-96可以下调PTPN9的表达水平，而STAT3的持续活化又可以是miR-96的转录水平上调，三者结合构成一条双重负反馈链条，进而介导癌症的发生侵袭[6]；(3)miR-126的低表达可以上调PTPN9的表达水平，从而促进肿瘤细胞的发生和侵袭[4]。

在JAK/STAT通路中，STAT3为血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的调节因子，STAT3的持续上调可以促进VEGF的表达增加，进而增加肿瘤的侵袭和转移能力[9-10]，PTPN9的低表达又能上调STAT3活性，与Hong，Hu等的研究结果相符合，但与本文和Zhu的研究结果相悖。查阅资料，发现PTPN9可以下调VEGFR2的功能和信号[11]，而VEGF和VEGFR2间存在着某种正反馈调节[12]。那是否在肝细胞癌和乳腺癌中存在着某种反馈机制，即PTPN9的低水平表达刺激STAT3的持续活化，进而上调VEGF的表达，从而增强肿瘤的恶性度，而相对在食管鳞状细胞癌和结直肠癌中PTPN9的高表达却抑制STAT3的活化，降低VEGF的表达强度，下调VEGFR2的功能，但这种趋势却并未抵消VEGF与VEGFR2之间的正反馈作用，甚至对其环路起到整体促进的作用，或CRC和ESCC中miR-126的低表达上调PTPN9的表达水平，从而促进肿瘤细胞的发生和侵袭，导致肿瘤的高病理学分期，但现尚无理论研究证明，详细的机制仍需要进一步研究和探讨。

PTPN9在现有研究中证实有着肝胰岛素信号的拮抗作用，即PTPN9的表达水平升高，抑制了肝脏中的胰岛素信号，一定程度上促进了胰岛素抵抗的发生[13]，但也有观点认为STAT3转录的增强，同样对于胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生起到了促进的作用[14]。这两种观点与现所知的，关于PTPN9的低水平表达刺激STAT3的持续活化的结论不完全一致。在本文结果中，显示随PTPN9的表达水平升高，糖尿病的发病率也随之升高。

综上所述，本研究证明PTPN9对于结直肠癌肿瘤发生发展有着干预作用，并且高表达的PTPN9对于结直肠癌患者的预后起到预测指标的作用，PTPN9可能作为一个新的基因治疗靶点用于抗击结直肠癌，从而提高患者的生存期。同时，其可能对糖尿病的发生和治疗有着提示作用，其具体机制尚需要进一步研究。