建立一种基于超高效液相色谱-串联质谱测定猪肉中地克珠利和妥曲珠利残留的方法

陈彤 吴雯娟 黄婷 丁燕玲 罗燕

摘  要：本文建立了一种检测猪肉中地克珠利和妥曲珠利残留的超高效液相色谱-串联质谱方法。地克珠利和妥曲珠利在10.0 μg/kg～500.0 μg/kg线性范围内，标准曲线的相关系数（r）均大于0.996，呈现良好的线性关系。地克珠利和妥曲珠利的检出限分别为1.22 μg/kg和1.25 μg/kg，在加标回收试验中的回收率范围分别为81.4%～105.0%和86.0%～103.0%，相对标准偏差范围为3.8%～6.2%。试验结果表明，该方法简单、快速、准确，且检出限低、回收率高，能适用于猪肉中地克珠利和妥曲珠利残留的检测。

关键词：地克珠利;妥曲珠利;残留;猪肉;超高效液相色谱-串联质谱

中图分类号：S859.84 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2019）08-0069-04

地克珠利与妥曲珠利都是三嗪类抗球虫药物，具有高效、低毒和广谱的驱球虫特性，在畜牧业生产中作为抗球虫药物被广泛应用[1]。妥曲珠利被动物吸收后，通过代谢转化为曲珠利砜和妥曲珠利亚砜。此类药物的药效时间短，实际生产中需要长期用药才能达到防治的目的，因而此类药物容易残留累积，经过食物链传递至消费者体内，影響消费者的健康。在生产中此类药物的使用具有严格的限量标准，《中华人民共和国农业农村部公告235号》规定了地克珠利在鸡肌肉中的最高残留量为500 μg/kg，妥曲珠利在鸡肌肉中的最高残留量为100 μg/kg[2]。

目前对地克珠利和妥曲珠利的测定方法主要有液相色谱法[3-4]和液相色谱质谱联用法[5-6]。液相色谱法存在较多缺陷，测定时各种化合物之间的干扰较大，造成各个目标峰的响应值相差很大。液相色谱质谱联用法可以减少色谱峰干扰的问题。但是地克珠利和妥曲珠利类化合物的特征是碎片离子少，因此用液相色谱质谱联用法测试该类化合物时，通常采用母离子的碎片信息定性定量。但母离子定性定量受基质效应的影响较大，造成测定结果发生偏差。高灵敏度且高选择性的高分辨质谱技术将能够大大避免这一弊端。木合他拜尔等[7]利用Q-Exactive技术测定了鸡肉中地克珠利和妥曲珠利的残留情况，取得了较低定量限的目标物质。但该方法的前处理过程对基质的净化程度不够，造成目标峰受到噪音效应干扰。本文对样本的提取、净化以及质谱条件进行了全面的优化，建立了具有高灵敏度和高选择性的超高效液相色谱-串联质谱法，同时快速准确、定性定量检测了猪肉中地克珠利和妥曲珠利药物。该方法操作简便，能大大缩短检测周期，灵敏度高且抗干扰能力强，这将为动物源性食品中地克珠利和妥曲珠利的快速检测提供科学的依据和参考。

1  材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

本次试验所用仪器为Aglient 1290超高效液相色谱仪、AB Sciex Triple QuadTM 5500 质谱仪（美国AB Sciex公司）、OAN-EVAP 24型全自动氮吹仪、TAITEC Mix-VR多管漩涡混合仪、梅特勒AG285型天平、IKAKS501型旋涡混合器、Sigma 3K15冷冻离心机、Millipor超纯水仪、新芝SB-1200DT型超声波清洗机和Waters PRIME HLB（6cc 200 mg）固相萃取柱。

1.1.2 药品与试剂

乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）和甲酸（色谱纯），乙腈水溶液中乙腈、水和甲酸的配比为80∶20∶0.2（体积比），复溶液中甲醇、水和甲酸的配比为10∶90∶0.09（体积比）。

标准物质地克珠利、妥曲珠利和氘代妥曲珠利均为德国Dr. Ehrenstorfer公司产品。

1.2 样本制备

取适量新鲜猪肉组织，充分绞碎且均质，于-20 ℃避光保存。

1.3 标准储备液和混合标准工作液的配制

准确称取地克珠利、妥曲珠利和氘代妥曲珠利的标准品，用甲醇分别配成1.00 mg/mL的标准储备液，于-18 ℃冰箱中保存。再分别移取适量地克珠利和妥曲珠利标准储备液，用甲醇逐级稀释成适当浓度的地克珠利和妥曲珠利混合标准工作液。

1.4 样本前处理

称取试样2.50 g，置于50 mL离心管中，按加标水平添加标准液。加乙腈水溶液10 mL，在振荡器上震荡10 min，超声提取5 min，   9 000 r/min离心6 min。移取3.5 mL上清液，直接过Waters PRIME HLB固相萃取柱（6cc，200 mg），保持1 s/滴的速度。用玻璃小管收集全部流出液，准确移出2.5 mL～15 mL带刻度小管内。洗脱液在40 ℃水浴下氮气吹至少于0.5 mL，残留液用复溶液定容至1.00 mL，过0.22 μm滤膜后，进行液相色谱-串联质谱测定。

1.5 超高效液相色谱-串联质谱条件

1.5.1 超高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm， 2.1 mm×100 mm）;流动相A相为0.1%甲酸水溶液;流动相B相为甲醇;柱温为40 ℃;进样量5.0 μL。梯度洗脱程序见表1。

1.5.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源;扫描方式：负离子扫描;检测方式：多反应监测;电喷雾电压：5 500 V;离子源温度：600 ℃;气帘气压力：28 psi;碰撞气压力：10 psi;雾化气压力：55 psi;辅助加热气压力（GS2）：60 psi。

定性离子对、定量离子对、采集时间、去簇电压及碰撞能量见表2，空白基质及添加药物样本色谱图见图1。

2  结果与讨论

2.1 标准曲线

按方法条件设置仪器参数，精密量取地克珠利和妥曲珠利混合标准溶液以及氘代妥曲珠利标准溶液适量添加到空白猪肉中，制得地克珠利和妥曲珠利浓度分别为10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、5.00 μg/kg、100 μg/kg、500 μg/kg各系列空白添加试样，按1.4试验方法处理试样，样液经过液相色谱串联质谱测定，以添加药物的浓度为横坐标，样本的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性范围、回归方程和相关系数见表3，地克珠利和妥曲珠利基质试验的线性范围在10.0 μg/kg～ 500.0 μg/ kg内，各化合物峰面积与其相应浓度呈现良好的线性相关，相关系数（r）均在0.996以上。

2.2 方法检出限确定

以空白猪肉样本为基质，做7个平行添加试验，地克珠利和妥曲珠利阳性添加浓度均为10.0 μg/kg，按照1.4所述的样本前处理方法全过程进行预处理和测定，上机测得地克珠利含量X1：9.391 μg/kg、10.39 μg/kg、                   9.709 μg/kg、9.953μg/kg、9.246 μg/kg、9.718 μg/kg和9.399 μg/kg;测得妥曲珠利含量X2：9.450 μg/kg、9.051 μg/kg、9.516 μg/kg、9.327μg/kg、8.773 μg/kg、 8.600 μg/kg和8.944 μg/kg。根据各样本检测值计算出平均值X及标准偏差Sb，按公式检出限=（k×Sb×C）/X （k为置信因子，一般取3）计算，计算出地克珠利和妥曲珠利方法检出限分别为1.22 μg/kg和1.25μg/kg。

2.3 回收率测定

用空白猪肉试样进行3个水平（10.0 μg/kg、50.0 μg/kg和500.0 μg/kg）的阳性添加回收试验，每个水平建立6个平行样本，按照1.4所述的样本前处理方法全过程进行预处理和测定。地克珠利和妥曲珠利的回收率和范围以及其相对标准偏差结果见表4。

表4回收率和相对标准偏差结果显示，该方法的回收率较好，相对标准偏差较低，地克珠利的回收率范围为81.4%～105.0%，相对标准偏差范围为3.8%～6.2%;妥曲珠利的回收率范围为86.0%～103.0%，相对标准偏差范围为4.1%～5.9%。方法检出限低、重复性好和回收率较好，可准确进行定性和定量检测，并且受基质效应的干扰较小。

3  结论

本文建立了畜禽肉中地克珠利和妥曲珠利残留量的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。方法采用乙腈水溶液提取，提取离心后直接过固相萃取小柱进行净化，过柱的要求低，操作簡单。试验结果表明，该方法检出限低、回收率较好和灵敏度高;液相色谱串联质谱的条件设置合理，相关参数优化较佳，该方法能有效消除基质效应的干扰，大大节约检测时间和人力物力，从而进一步提高检测的效率。多种食品样本的实测试验证明，本方法适用于动物肌肉组织中地克珠利和妥曲珠利的快速的定性定量检测。□□

参考文献：（7篇，略）