贵州不同产地雪胆药材有效成分研究

王志春，陈薇薇，郭小梅，沈昱翔

(安顺学院，贵州 安顺 561000)

雪胆为西南民间常用药材，基源为葫芦科植物雪胆属(Hemsleya)多种植物的块茎。本属植物按照中国植物志记载共31种，其中包括10个变种[1]，在我国西南地区都有分布[2]，其中贵州、云南、四川三省拥有全属植物的92%[3，4]。雪胆具有抗菌消炎、清热解毒等功效，在临床治疗冠心病、肠炎、气管炎、慢性子宫颈炎、菌痢等多种疾病时都应用到了此药材，并对保肝、抗癌等也发着挥极大作用[5-8]；雪胆属植物具有抗菌、抗炎、溶血、抗癌等活性作用的物质基础是其含有葫芦素和齐墩果烷两大类三萜皂苷[9]。

贵州地区常称雪胆属药用植物为“蛇莲”“苦金盆”[10]，贵州地区亦是雪胆商品药材的重要产地，当地多民族广泛使用此类药材，如贵州知名药企“神奇药业”著名民族药“雪胆素片”就是以其为原料生产，因此雪胆属植物为贵州省重要的药用植物资源，但是目前关于贵州省雪胆药材资源的相关研究较少。为保证用药安全，本研究调查了贵州雪胆属药用资源的分布情况，并收集了贵州兴义、毕节、安顺、遵义、六盘水等不同产地的雪胆块茎样品，并对醇溶性浸出物、总黄酮、雪胆素甲和总皂苷含量进行了检测并分析其相关性因素，以期为以后大规模的种植和资源开发利用提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

赛多利斯Bp211DAG电子天平(德国Sartorius公司)；Agilent1200 Series高效液相色谱仪(G1316B柱温箱、G1312B四元梯度泵、G1315C二极管阵列紫外检测器、G1322A脱气机、G1329B自动进样器)；超声波清洗器KQ5200DB(昆山市超声仪器有限公司提供)。

1.2 实验材料

雪胆素甲(111518-201103)由中国食品药品检定研究院提供；齐墩果酸对照品、芦丁对照品由阿拉丁试剂(上海)有限公司提供；水为重蒸馏水；乙腈为色谱纯；乙醇、甲醇、冰醋酸、石油醚、硝酸铝、正丁醇、高氯酸、香草醛、亚硝酸钠、氢氧化钠等试剂均为国产分析纯。

雪胆药材收集于贵州不同产区，所有样品均收集带有地上部分的植株以利于鉴定，对应块茎带回实验室备用，样品情况见表1。

2 研究方法

2.1 样品处理

对贵州兴义、毕节、遵义、安顺、六盘水等雪胆药材产地进行调查，查阅文献资料，整理及分析贵州雪胆药材的资源使用情况。清洗野外收集到的雪胆块茎，对其鲜重进行称量、切片，将其自然阴干，阴干后的材料研磨成粉末状，用于总黄酮、醇溶性浸出物、雪胆甲素含量及总皂苷的检测，每组实验重复做5个。

2.2 雪胆甲素含量的测定

2.2.1 色谱条件和系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶填充；以乙腈∶水=40∶60，检测波长为212 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃。

2.2.2 对照品溶液的制备 取适量的雪胆素甲对照品，称重，加乙腈，制成每1.0 mL含0.143 mg雪胆素甲的对照品溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 分别称取每个样品粉末约1.0 g，称定重量，置于带瓶塞的锥形瓶中，加入25 mL甲醇，称定重量，先超声处理30 min，然后放冷，再称定重量，减失的重量用甲醇补足，摇匀，滤过，取滤液，即得。

2.3 总皂苷含量的测定

2.3.1 供试液的制备 每个样品各称取粉末 1.0 g，加入70%乙醇15 mL，提取1 h，共提取5次。将滤液合并且挥干其溶剂，用蒸馏水定容至10 mL，先用20 mL石油醚脱脂，然后用适量正丁醇萃取并挥干萃取液，用 50%乙醇定容得到溶剂50 mL备用。

2.3.2 对照品溶液的制备 称取齐墩果酸对照品1.8 mg，置入烧杯，然后用甲醇溶解，并稀释至 25 mL，作为对照品溶液。

2.3.3 标准曲线的制备 量取对照品溶液1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0 mL置于试管，放水浴锅中加热挥干其甲醇，加入新配5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL和高氯酸1.0 mL，在65 ℃下水浴加热20 min。放冷，待冷却至室温后加10 mL冰醋酸，并将其摇匀。绘制出标准曲线，得到回归方程：Y=0.426 4X-0.151 9，R1=0.999 5。

2.3.4 样品溶液的测定 取0.6 mL样品溶液，按照标准曲线的制备方法测定样品，总皂苷含量的计算对照标准曲线方程进行[11]。

2.4 总黄酮含量的测定

参考钟文等[12]所用方法制备供试液、对照品溶液及标准曲线，得到回归方程：Y=0.167 4X+0.036 8，R2=0.999 3。

2.4.1 样品溶液的测定 量取1.00 mL黄酮提取液，置于 10 mL 容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，摇匀，静置 8 min；再加入 10%硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀，放置8 min；加入 5%氢氧化钠溶液 5 mL，再加水至刻度，摇匀，静置20 min；总黄酮的含量根据标准曲线计算得出。

2.5 醇溶性浸出物用热侵法进行测定

参照《中国药典》(2010年版1部)附录 X A 醇溶性浸出物测定法[13]。精密称取各样品粉末2 g，各置于具塞圆底烧瓶(100 mL)中，加水50 mL，盖上瓶塞，称重，放置1h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸状态1 h；放冷，冷却后取下圆底烧瓶，盖上瓶塞，称定其重量，把减失的重量用水补足，摇匀后过滤；用量筒量取滤液25 mL，放入蒸发皿中，用水浴蒸干后，在105 ℃下，干燥3 h，移置干燥器中，冷却1 h，立刻称其重量；样品中含水溶性浸出物的百分数以干燥品来计算。

3 结果

3.1 贵州雪胆属资源概况

根据《Flora of China》与《云南雪胆属植物药用资源的初步研究》的记载，贵州有8种、1原亚种、3原变种雪胆属植物具有块茎[14，15]，主要分布在贵州西部、西北部及东南部至西南部地区，由于其属在贵州分布范围较广，本项目组实际收集到带花、果等繁殖器官的雪胆植株标本共7份，经贵州省安顺学院陈薇薇老师鉴定其基源为肉花雪胆(HemsleyacarnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)和雪胆(H.amabilisDiels)两种，其中肉花雪胆(H.carnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)主要分布在贵州西北部到西部海拔较高的区域(本次收集到肉花雪胆样品海拔均为1 500 m以上)，资源量大，并且在毕节、黔西南等地已经有一定规模的引种栽培，并形成商品；而雪胆(H.amabilisDiels)则分布在海拔较低区域，未见有大量栽培引种，多为当地民间使用，商品量较少。

表1 雪胆属药材样品调查结果

3.2 不同产地雪胆药材有效成分含量及品质差异

本研究收集到贵州7个雪胆样品的雪胆甲素平均含量为1.39%，总黄酮的平均含量为2.24%，总皂苷的平均含量为0.78%，醇溶性浸出物的平均含量为17.09%。总体来看，贵州雪胆有效成分含量较高。其中样品S3(桂果镇)的雪胆甲素含量最高，达4.46%，比平均含量高出3.07%；总皂苷含量最高的是样品S3，含量为1.08%，比平均含量高0.30%；总黄酮最高的也是样品S3，含量为5.19%，比平均含量高2.95%；醇溶性浸出物含量最高的样品还是S3，含量为22.78%，比平均含量高5.69%。综合分析雪胆甲素、总皂苷、总黄酮及醇溶性浸出物等多个指标，样品S3的药材品质优良。本项目所收集的7个样品中，基源为雪胆(H.amabilisDiels)的有3个，雪胆甲素的平均含量是2.27%，总黄酮的平均含量是2.99%，总皂苷的平均含量是0.96%，醇溶性浸出物的平均含量是16.47%。基源为肉花雪胆(H.carnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)的有4个，雪胆甲素的平均含量是0.73%，总黄酮的平均含量是1.69%，总皂苷的平均含量是0.65%，醇溶性浸出物的平均含量是17.56%。结果表明，肉花雪胆(H.carnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)的雪胆甲素、总皂苷、总黄酮均高于雪胆(H.amabilisDiels)，而醇溶性浸出物低于雪胆(H.amabilisDiels)。总体分析，不同产地雪胆药材活性成分含量有差异，其中毕节市桂果镇所产样品有效成分含量高于六盘水市普古镇、安顺市猫营镇等地样品，品质优良；肉花雪胆(H.carnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)药材品质优于雪胆(H.amabilisDiels)药材。检测结果见表2和图1。

表2 不同产地有效成分检测结果 (%)

注：n=3。

图1 不同产地雪胆有效成分含量差异

4 讨论

雪胆是我国重要的药用植物，作为民间药材和原料药材，具有较大的市场需求，然而目前主要依靠野生植株提供商品，加上长期掠夺性采挖，目前雪胆资源已经出现危机，野生资源逐渐稀少。据文献记载，贵州具块茎雪胆共有8种、1原亚种、3原变种，但是本次调查仅收集到2种，即肉花雪胆(H.carnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)和雪胆(H.amabilisDiels)，前者多分布于贵州西部、西北部海拔1 500 m以上区域的阔叶林下或灌木从中，而后者则分布在海拔1 000 m左右低海拔阔叶林中。在走访过程中，据药农反映近年来雪胆的资源逐渐减少，个头大的植株已多年不见，表明雪胆属植物资源受到较严重的破坏，究其原因，可能与雪胆在多个地区的民间都有大量使用及商品收购，同时野生雪胆栖息环境被破坏等多种因素有关。目前市场上有多种以雪胆药材为主要原料的药品，甚至牙膏等日化用品的原料也有用到雪胆药材，因此解决雪胆资源的日益减少势在必行。在本次调查中发现，仅有桂果镇、七舍镇等部分地区在进行小规模人工栽培，栽培雪胆的资源量远远不能满足市场需求，资源的缺乏已对制药企业带来极大的困扰。因此，应进一步研究雪胆植物的繁殖技术及繁殖方法，为规模化无性繁殖及人工驯化提供技术支撑。

本研究分析了贵州7个雪胆药材样品的主要药用成分，包括雪胆甲素含量、总皂苷含量、总黄酮含量和醇溶性浸出物等，结果表明不同产地的雪胆药材在药用成分含量上存在一定的差异，雪胆药材品质具有显著的地域差异性。同时，根据实验结果，贵州产肉花雪胆醇溶性浸出物的平均含量是22.78%，雪胆甲素的平均含量是4.46%，总黄酮的平均含量是5.19%，总皂苷的平均含量是1.08%，高于四川、浙江等地的药材样品[16，17]，同时肉花雪胆在贵州西北部地区，如毕节的桂果镇、黔西南州七舍镇等区域，已经有一定的规模化引种栽培，并形成了商品，其种植技术、种源获取等均较雪胆属其他品种成熟，表明肉花雪胆是优质的雪胆药材储备资源，在今后的研究中应该引起重视。

同时，雪胆药材多用于提取如总皂苷等作为原料药材使用，除块茎外，尚有大量地上部分未被开发利用。林晓琴等[18]研究发现雪胆同属植物马铜铃(H.gracilifloraCogn)，除块茎外，花、叶、果实等也含有雪胆甲素等活性成分，因此我们可以进一步对贵州雪胆属植物的茎、叶、果实等器官的有效成分进行研究，为开发、利用雪胆属植物的非传统药用部位提供理论依据。