鹤寿酒质量标准研究

焦 玉，黄德红，王兵娥，岳国超，张 荔

(襄阳市中医医院 药学部，湖北 襄阳 441000)

酒剂又名药酒。药酒的应用历史悠久，发展至今已经比较成熟，将强身健体的中药材与酒融合在一起配制成药酒，配制方法相对较为简便，药物性质趋于稳定。药材成分通过蒸馏提取，将有效成分融于酒中。通过饮服或外涂达到调整亚健康、防病治病、保健延年的功效。常用提取方法有冷浸法、热浸法、渗漉法等[1]。

鹤寿酒为我院协定方，处方由西洋参、鹿茸、枸杞子、淫羊藿等18味中药组成，处方来源于名老中医经验方。西洋参性凉，味甘、微苦，能补气养阴，清热生津。鹿茸性温，味甘、咸，可壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒。枸杞子味甘性平，能滋补肝肾，益津明目。全方共奏补益心肾、健脾祛湿、活血化瘀之功。为进一步研究其药效物质基础，并使其质量可控，对其进行了质量标准研究。

1 仪器与试药

1.1 样品、材料与试剂

供试验用鹤寿酒由襄阳市中医医院生产，批号：20180109、20180402、20181008。缺枸杞子、西洋参和淫羊藿的阴性对照样品溶液分别按鹤寿酒的处方和工艺制备。枸杞子对照药材(购自南阳康正药业有限公司，经本院药检室万宏主任药师鉴定为茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实)，西洋参(购自天济中药饮片有限公司，经本院药检室万宏主任药师鉴定为五加科植物西洋参PanaxquinquefoliumL.的干燥根)，淫羊藿对照药材(购自南阳康正药业有限公司，经本院药检室万宏主任药师鉴定为小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicornuMaxim.的干燥叶)，人参皂苷Rb1对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110704-200420)，人参皂苷Re对照品(北京恒元启天化工技术研究院，批号：MUST-11041201)，人参皂苷Rg1对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110703-200726)，淫羊藿苷对照品(成都埃法生物科技有限公司，批号：ABP290020，纯度98%)，葡萄糖对照品(成都埃法生物科技有限公司，批号：AB17030602，纯度98%)，鹤寿酒样品(批号：20180402)。薄层层析用硅胶G(青岛海洋化工有限公司)。硫酸(分析纯，武汉市中天化工有限责任公司)，苯酚(天津市胜利制药厂)。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

UV-757分光光度计(上海奥普勒仪器有限公司)；TG328A型光学读数分析天平(湘仪天平仪器厂)；DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；ZF-I型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)；KQ2200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；800型离心沉淀器(上海手术器械厂)。

2 薄层鉴别

2.1 枸杞子的鉴别

取样品30 mL，水浴蒸至无乙醇味，加水20 mL使其溶解，二氯甲烷萃取2次，每次20 mL，乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇约1 mL使其溶解，作为供试品溶液。另取枸杞子对照药材0.5 g，加35 mL水，加热煮沸15 min，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯15 mL振摇提取，分取乙酸乙酯液，浓缩至1 mL，作为对照药材溶液。取缺枸杞子的阴性样品，按照供试品溶液制备方法制备，作为阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(9∶3∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰。薄层色谱见图1。

1、2、3分别为批号20180109、20180402、20181008的样品；4.枸杞子对照药材；5.缺枸杞子的阴性对照品

图1 枸杞子溶液薄层色谱

2.2 西洋参的鉴别

取枸杞子薄层鉴别项下的水溶液，加水饱和的正丁醇萃取2次，每次20 mL，水洗涤2次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为对照品溶液。另取西洋参对照药材1 g，加40%乙醇30 mL超声20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，水洗涤2次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。再取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1 mL各含2 mg的溶液，分别制成对照品溶液。取缺西洋参的阴性样品，按照供试品溶液制备方法制备，作为阴性样品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述6种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶20∶11∶5)5～10 ℃放置12 h的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点或荧光斑点。阴性对照无干扰。薄层色谱见图2。

1、2、3分别为批号20180109、20180402、20181008的样品；4.西洋参对照药材；5.人参皂苷Rg1对照品；6.人参皂苷Re对照品；7.人参皂苷Rb1对照品；8.缺西洋参的阴性对照品日光下检视

1、2、3分别为批号20180109、20180402、20181008的样品；4.西洋参对照药材；5.人参皂苷Rg1对照品；6.人参皂苷Re对照品；7.人参皂苷Rb1对照品；8.缺西洋参的阴性对照品紫外光(365nm)下检视

图2 西洋参薄层色谱

2.3 淫羊藿的鉴别

取枸杞子鉴别项下的供试品溶液，另取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点；喷以三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365 nm)下检视，显相同的橙红色荧光斑点。阴性对照无干扰。薄层色谱见图3。

1、2、3分别为批号20180109、20180402、20181008的样品；4.淫羊藿苷对照品；5.缺淫羊藿的阴性对照品紫外光灯(365nm)下检视

1、2、3分别为批号20180109、20180402、20181008的样品；4.淫羊藿苷对照品；5.缺淫羊藿的阴性对照品喷以三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365nm) 下检视

图3 淫羊藿薄层色谱

3 含量测定

3.1 指标性成分的选择

根据鹤寿酒的功效，以及各药材所含成分，并确定含量测定的指标为有效部位多糖成分。采用紫外分光光度法测定多糖的含量[2]。

3.2 对照品溶液的制备

精密称取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品10 mg，加水定容至100 mL容量瓶中，作为对照品溶液。

3.3 标准曲线绘制

分别精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10 mL置100 mL容量瓶中。再精密吸取1 mL至10 mL量瓶中，加入1.5 mL 5%苯酚溶液，摇匀，再缓缓加入浓硫酸定容至刻度，摇匀，放置30 min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在490 nm处测定吸光度。以吸光度Y为纵坐标，浓度X为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.071 3X+0.024 5，r2=0.999 2。标准曲线见图4。

图4 溶液标准曲线

3.4 含量测定

精密吸取样品1 mL，加无水乙醇定容至25 mL量瓶中，精密吸取10 mL，离心10 min，弃去上清液。残渣加水分次转移至25 mL量瓶中，加水定容至刻度。再精密吸取1 mL至10 mL量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加入1.5 mL 5%苯酚溶液”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中多糖的总量，计算，即得。

3.5 方法学考察

3.5.1 精密度试验 精密吸取对照品溶液，浓度为3.84 μg/mL，照标准曲线法测定，连续平行测定6次，吸光度值分别为0.308、0.306、0.304、0.305、0.309、0.311，RSD值为0.86%，表明仪器精密度良好。

3.5.2 重复性试验 取同一批样品(批号为20180402)，按照供试品溶液制备和显色方法，490 nm下测定，平行试验6次，测得结果分别为41.84、42.16、41.76、43.74、42.95、42.47 mg/mL，平均含量为42.49 mg/mL，相对标准偏差RSD值为1.77%，表明其重复性良好。

3.5.3 稳定性试验 取同一批样品(批号为20180402)，按照供试品溶液制备方法和显色，分别放置0 min、20 min、40 min、60 min，80 min、100 min下测定，吸光度值分别为0.528、0.527、0.534、0.532、0.535、0.538，其相对标准偏差RSD为0.79%，表明样品在100 min内稳定。

3.5.4 加样回收率试验 精密吸取1 mL已知多糖含量为42.49 mg/mL的样品溶液(批号为20180402)6份，加无水乙醇定容至25 mL容量瓶中，精密量取10 mL，离心10 min，弃去上清液。残渣加水分次转移至25 mL量瓶中，加水定容至刻度。精密吸取0.5 mL至10 mL量瓶中，精密加入0.5 mL对照品溶液(浓度为38.42 μg/mL)，再加1.5 mL 5%苯酚，摇匀，再缓缓加入7.5 mL浓硫酸，显色30 min。在490 nm处测定吸光值。计算平均回收率为97.34%，RSD为1.65%，符合要求。见表1。

表1 加样回收率试验结果

3.5.5 样品测定 3批样品批号分别为20180109、2018-0402和20181008，按照供试品溶液制备方法和显色，490 nm下测定，多糖含量分别为53.06 mg/mL、42.49 mg/mL、50.24 mg/mL。根据上述测定结果，考虑到药材的来源，以及制剂生产、贮藏等因素，将平均含量下浮20%，暂定本品每1 mL含多糖不得少于38.9 mg。

4 结语

用药酒治疗疾病是中医学中一种古老而独特的疗法，在我国已有几千年的应用历史。酒的主要成分乙醇是一种良好的半极性有机溶媒，大部分水溶性物质及极性大的物质都能在其中溶解，中药的多种成分如生物碱、有机酸、树脂、糖类等均较易溶解于乙醇中[3]。鹤寿酒系将低浓度白酒采用渗漉的方法提取，其有效成分能溶解其中，达到治疗疾病、强身健体的作用。

按照处方的方解及君臣佐使的顺序，对其进行薄层色谱鉴别。分别以甘氨酸为对照品考察了制剂中的鹿茸，黄芪对照药材和黄芪甲苷为对照品考察了黄芪，金丝桃苷为对照品考察了菟丝子，均未显示出与对照品相同的斑点，因此不作为鉴别指标。

在含量测定预实验中，对离心次数进行了考察。精密吸取样品1 mL，加无水乙醇定容至25 mL容量瓶中，精密吸取10 mL，离心10 min，弃去上清液。残渣加乙醇10 mL混匀，再次离心10 min，发现未有沉淀，表明1次离心已沉淀完全。

对显色系统进行了考察，分别考察了浓硫酸-苯酚系统，即先加入1.5 mL 5%苯酚，摇匀，再缓缓加入7.5 mL浓硫酸，和浓硫酸-蒽酮系统，即0.2%浓硫酸-蒽酮，490 nm下测定二者的吸光度大小，最终选择了浓硫酸-苯酚系统，490 nm下检测。

另外，对显色时间也进行了考察，加入苯酚和浓硫酸后，分别考察了显色时间10 min、20 min、30 min和40 min，结果表明30 min后吸光度不再变化，因此确定为显色30 min。

本实验结果表明，采用薄层色谱法对制剂中的枸杞子、西洋参、淫羊藿进行鉴别，采用分光光度法测定制剂中多糖的含量，方法简便快捷，准确度高，精密度好，可作为本制剂的质量控制方法，亦可为其他复方制剂中含相同药味的制剂标准的制定提供参考。