复方扶芳藤合剂对D-半乳糖联合AlCl3所致痴呆小鼠学习记忆改善作用研究

包传红,农汝楠，孙 健，韦仁安，吴燕春*

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西中药药效研究重点实验室，广西 南宁 530200)

阿尔茨海默病(AD)又名老年性痴呆，作为一种慢性神经退行性疾病，AD患者在行为上表现出认知困难、学习记忆能力减退等。复方扶芳藤合剂(FFH)又名百年乐，由红参、扶芳藤、黄芪组成，具有益气补血、健脾养心、活血化瘀的功效。现代药理学研究表明FFH具有抗氧化、提高免疫力[1]及抗衰老作用[2]。临床用FFH治疗慢性疲劳综合征[3]及防治老年血管性痴呆，增强记忆力[4]。目前AD病因及发病机制不明，但氧化应激及胆碱能神经的退化是导致AD发病的重要因素。因此本研究从抗氧化应激及胆碱能神经递质传导机制验证FFH对D-半乳糖和AlCl3所致痴呆小鼠学习记忆能力的影响，为FFH治疗AD提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 60只SPF级昆明种小鼠，体重(20±2)g，雌雄各半。由广西医科大学提供(许可证号：SCXK：桂2014-0003)。

1.1.2 药品和试剂 复方扶芳藤合剂(广西中医药大学制药厂)；石杉碱甲(辰欣药业股份有限公司)；D-半乳糖(Solarbio)；AlCl3(上海豪申化学试剂有限公司)；SOD、GSH-PX及ChAT试剂盒(武汉华美工程公司)；MDA、Ach及AchE酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.3 仪器 Morris水迷宫设备全套(成都泰盟生产)；全自动酶标仪(美国Thermo scientific公司，型号：Multiskan MK)；台式高速离心机(美国Thermo scientific公司，型号：ST16)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与给药 将昆明种60只小鼠分为正常对照组、模型对照组、石杉碱甲组和复方扶芳藤合剂高剂量组(9 g·kg-1)、中剂量组(4.5 g·kg-1)、低剂量组(2.25 g·kg-1)，每组10只。正常对照组腹腔注射生理盐水，模型对照组和各给药组腹腔注射D-半乳糖90 mg·kg-1及灌胃AlCl340 mg·kg-1，连续90 d[5]。造模成功后，分别给予石杉碱甲及复方扶芳藤合剂，正常对照组和模型对照组灌胃给予生理盐水，20 mL·kg-1，每天1次，连续30 天。

1.2.2 Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力 Morris水迷宫实验时间为6天，分为两个阶段：定位航行和空间探索。水迷宫实验第1天，撤除平台，让实验各组小鼠在水池中自由游泳2 min，第2天则为定位航行阶段，总共5天，将小鼠面向池壁由4个入水点放入次池中，检测小鼠在60 s内成功进驻平台需要的时间(即逃避潜伏期)。最后一天进行空间搜索实验，撤除平台，让小鼠在水池中自由游泳，记录其寻求次数及停留时间(站台直径2倍范围)。

1.2.3 小鼠脑组织SOD、GSH-PX、MDA、ChAT、Ach及AchE含量测定 水迷宫实验后，摘眼球采血后置于冰上取脑，用冷的生理盐水溶液冲洗残血，在滤纸上拭干。称取脑组织后剪碎，置组织匀浆器中，加入9倍生理盐水溶液，制备成10%组织匀浆，根据试剂盒说明书进行操作，采用化学法测定小鼠脑组织MDA、Ach及AchE含量；ELISA法检测小鼠脑组织SOD、GSH-PX及ChAT含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理。计量数据采用单因素方差分析(ANOVA)，各组之间两两比较采用LSD检验，方差不齐时经秩转换后进行两两比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠Morris水迷宫行为5天的潜伏期变化结果

与正常对照组比较，模型对照组的逃避潜伏期明显延长，从第1天到第5天正常对照组与模型对照组对比有差异(P<0.05或P<0.01)，与模型对照组比较，复方扶芳藤合剂高剂量组从第3天开始到第5天的逃避潜伏期存在差异(P<0.05或P<0.01)。中剂量第5天的逃避潜伏期比较差异有统计学意义(P<0.05)，低剂量有趋势，但比较差异无统计学意义(P>0.05。结果见表1。

组别第1天第2天第3天第4天第5天正常对照组50.28±10.24∗41.11±9.83∗33.43±12.36∗25.22±10.36∗∗18.28±8.73∗∗模型对照组55.65±10.0150.21±11.2147.06±14.2643.28±13.3835.32±12.08石杉碱甲组55.10±7.8246.33±8.7539.03±12.86∗31.28±10.66∗∗24.32±8.33∗∗复方扶芳藤合剂高剂量组55.36±9.3546.58±9.4841.03±12.34∗33.48±11.04∗∗26.08±9.06∗∗复方扶芳藤合剂中剂量组55.54±9.7847.98±9.6741.92±13.5336.48±11.9827.86±10.89∗复方扶芳藤合剂低剂量组55.66±9.9347.88±9.5942.43±13.1337.12±12.0633.36±12.32

注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 复方扶芳藤合剂对痴呆小鼠寻求次数及停留时间的影响

①寻求次数：各组寻求次数相对模型对照组明显增多，与模型对照组比较，复方扶芳藤合剂高剂量及中剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，低剂量有趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；②停留时间：各组停留时间相对模型对照组都延长，与模型对照组比较，复方扶芳藤合剂高剂量差异有统计学意义(P<0.01)，中剂量及低剂量有趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表2。

组别剂量(g/kg)寻求次数(F)停留时间(s) 正常对照组- 11.60±2.76∗∗ 18.03±3.32∗∗ 模型对照组-7.10±1.1911.02±1.27 石杉碱甲组0.01810.20±1.87∗∗ 14.87±2.01∗∗复方扶芳藤合剂高剂量组9 9.70 ±1.56∗∗13.94±2.25∗∗复方扶芳藤合剂中剂量组4.58.70±1.34∗12.49±1.75复方扶芳藤合剂低剂量组2.257.90±1.2911.65±1.49

注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 复方扶芳藤合剂对痴呆小鼠脑组织SOD、GSH-PX、MDA含量的影响

①SOD：与模型对照组比较，正常对照组、石杉碱甲组和FFH高、中剂量组的SOD含量明显升高，差异有显著统计学意义(P<0.01)，而FFH低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。②GSH-PX：与模型对照组比较，正常对照组、石杉碱甲组、FFH高剂量组GSH-PX含量明显升高，差异有显著统计学意义(P<0.01)，FFH中剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；③与模型对照组比较，复方扶芳藤合剂高剂量组MDA水平明显降低，差异有显著统计学意义(P<0.01)，中剂量组与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表3。

组别给药剂量(g/kg)SOD(μg·mL-1)GSH-PX(μg·mL-1)MDA(U/mol)正常对照组—169.5±19.32∗∗132.3±8.64∗∗21.34±3.45∗∗模型对照组—88.48±11.3371.11±7.8356.46±6.32石杉碱甲组0.018141.9±12.98∗∗110.3±7.78∗∗34.77±4.43∗∗复方扶芳藤合剂高剂量组9129.3±11.21∗∗98.33±9.09∗∗39.21±4.59∗∗复方扶芳藤合剂中剂量组4.5112.6±11.22∗87.41±8.33∗44.61±5.56∗复方扶芳藤合剂低剂量组2.2594.56±9.8883.55±7.45∗52.36±6.34

注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 复方扶芳藤合剂对痴呆小鼠脑内Ach、AchE酶及ChAT酶含量的影响

①与模型对照组比较，复方扶芳藤合剂高剂量组Ach活性明显升高(P<0.01)，中剂量组也增高(P<0.05)；②与模型对照组比较，复方扶芳藤合剂高剂量组AchE酶含量明显降低(P<0.01)，中剂量组AchE酶含量降低(P<0.05)；③ChAT含量：与模型对照组比较，复方扶芳藤合剂高剂量组及中剂量组ChAT含量均明显增高(P<0.01)，低剂量组也升高(P<0.05)。结果见表4。

组别给药剂量(g/kg)Ach(μg·mg/prot)AchE酶(U·mg/prot)ChAT酶(μg·mL-1)正常对照组—118.7±13.01∗∗0.45±0.08∗∗133.6±15.46∗∗模型对照组—70.23±8.251.19±0.1380.22±8.55石杉碱甲组0.018102.5±10.22∗∗0.68±0.09∗118.3±13.88∗∗复方扶芳藤合剂高剂量组994.63±9.33∗∗0.76±0.11∗∗108.6±13.01∗∗复方扶芳藤合剂中剂量组4.586.65±9.11∗0.97±0.16∗102.3±11.04∗∗复方扶芳藤合剂低剂量组2.2576.55±8.651.05±0.1693.55±9.22∗

注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

中医学认为AD的产生主要与肾精亏虚、气血不足、瘀血内阻、痰浊壅盛等有关。复方扶芳藤合剂由红参、扶芳藤、黄芪组成，能益气补血、健脾养心、活血化瘀，符合中医治疗AD的理论。AD患者在行为上表现出学习记忆能力减退，因此本实验用D-半乳糖联合A1C13造成小鼠学习障碍后，采用Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力，结果表明给予复方扶芳藤合剂后小鼠在逃避潜伏期明显降低，寻求次数增多，停留时间延长。

自由基损伤学说是AD的重要发病机制。本实验采用D-半乳糖联合A1C13造模，是因为D-半乳糖代谢过程中会产生活性氧或自由基，过量的活性氧或自由基引起神经细胞的氧化应激损伤，造成机体学习记忆能力下降[5]，而铝是一种慢性蓄积性神经毒素，A1C13毒性可损害膜结构，介导脂质过氧化[6]，所以D-半乳糖联合A1C13可引起和促进AD的发生、发展。

自由基损伤后会造成细胞内环境紊乱，导致细胞老化、死亡。在机体自由基代谢过程中，SOD能将过氧化物自由基转变成H2O2，后者在GSH-PX或过氧化脂质分解时可产生丙二醛(MDA)等醛类，形成脂褐素，沉积于脑导致认知障碍[7，8]。因此SOD及GSH-PX的活性能在一定程度上反映机体的自由基清除能力。本实验结果表明复方扶芳藤合剂能显著升高SOD、GSH-PX含量，降低MDA含量。

胆碱能损伤学说是目前公认的AD发病机制。大脑学习记忆能力与胆碱能神经系统有密切关系，乙酰胆碱是胆碱能神经重要的神经递质，其由乙酰胆碱转移酶(CHAT)催化合成，释放后作用于M受体，产生作用后，又被乙酰胆碱酯酶(AchE)催化分解成胆碱和乙酸，从而保持一种动态平衡，使认知功能正常发挥。因此ChAT和AchE共同作用调节Ach的动态平衡，对Ach合成及代谢途径具有重要意义[9]。在发生AD时，基底前脑的胆碱能神经元丢失，造成乙酰胆碱的合成、储存、释放减少，AchE降低[10]。本实验结果表明，复方扶芳藤合剂能显著提高ChAT酶的含量，降低AchE的含量，使其生成的Ach 含量增多。

综上所述，复方扶芳藤合剂可显著升高SOD、GSH-PX、Ach及ChAT含量，降低MDA及AchE酶含量。复方扶芳藤合剂具有改善痴呆小鼠学习记忆能力的作用，可能与其抗氧化作用及影响胆碱能神经递质传导有关。