黄腐酸肥料对小麦根际土壤微生物多样性和酶活性的影响

刘佳欢，王 倩，罗人杰，陈 喜，孙淑娟*

（1 山东农业大学资源与环境学院，山东泰安 271018；2 山东农业大学水利土木工程学院，山东泰安 271018）

我国是一个人口众多的农业大国，随着人口增长和生活水平的不断提高，人们对粮食和农作物的需求量随之增长，同时肥料的施用量也急剧增长。由于施肥不均衡和过度施肥，重大量元素肥料、轻中微量元素肥料，重化肥、轻有机肥，重氮肥、轻磷钾肥等问题突出[1-2]，给农业和生态环境造成了不良影响和严重后果。

黄腐酸是一种天然的有机大分子化合物的混合物，在自然界中稳定存在。对于肥料来说，黄腐酸可以充当复合材料 (大、中、小分子)、功能材料 (氮素提取和活性磷钾促进)、抗逆材料 (如抗旱、抗寒、抗涝、抗病虫害等功能的材料) 和络合材料或螯合材料[3]。因为黄腐酸具有刺激和调节作物生长，改良土壤理化性质，提高肥料利用率，增强作物的抗逆性等特点，已广泛应用于小麦、玉米、棉花等作物上，并取得了良好的效果。本研究所使用的黄腐酸肥料是一种带有活性微生物的有机菌剂肥料，兼有生物肥和有机肥的优点，既可以增产增收，改良土壤，又可以培肥土壤，提高土壤酶活性，改善土壤微生物群落结构，同时还可以提高作物品质，减少病害。

土壤微生物和土壤酶在土壤的物质转化和能量流动过程中起着极其重要的作用。土壤微生物的数量与土壤有机质的分解和矿质元素的转化有关，同时还影响着植物对氮、磷等营养元素的吸收和利用。土壤酶主要来自于植物根系和土壤生物的分泌物，其活性常作为土壤生物活性及土壤综合性状的表征，其中脲酶、磷酸酶活性反映了土壤中氮、磷的转化强度。目前，有许多文献在添加了微生物菌剂的有机肥料对作物生长状况、增产效果以及土壤微生物数量和功能及土壤酶活性等方面进行了深入地研究[4-8]。李江[9]利用Biolog法研究了丛枝茵根和复合基质对矿区微生物群落和功能多样性的影响，发现在复垦基质中添加30%的污泥然后接种丛枝菌根真菌，可以显著提高土壤中微生物的群落功能多样性。解媛媛等[10]研究发现，添加了微生物菌剂的肥料可以显著提高土壤酶活性。王义等[11]研究了丛枝菌根真菌对采煤塌陷地的玉米生长发育的影响，发现在接种了菌根真菌后复垦土壤酸性磷酸酶活性明显提高，并且玉米根际土壤微生物数量明显增加。马忠明等[12]研究表明在农田定位施肥条件下，土壤过氧化氢酶和蔗糖酶活性皆明显提高。刘骁蓓等[13]研究发现配施有机肥可以有效改善土壤营养环境，为微生物提供大量的营养和能源，从而更有利于微生物的生长和繁殖。本研究主要测定了小麦根际土壤中微生物的数量及功能多样性，以及土壤中酸性磷酸酶、过氧化氢酶、脲酶、蔗糖酶的活性，为制定科学的施肥制度和构建健康的土壤环境提供依据。本研究所使用的Biolog法可以有效测定土壤微生物对不同碳源的利用能力和代谢能力，在一定程度上能够反映土壤微生物群落多样性状况[14]。本研究所选用的植物是小麦，小麦是我国北方最常见的粮食作物，筛选适用于小麦的有机肥料，对改良土壤及提高产品品质，具有重要意义。

本文通过模拟自然环境的盆栽试验，研究在无机肥的基础上增施不同量的黄腐酸肥料对小麦根际土壤的土壤酶活性和微生物数量、功能多样性的影响，旨在充分展示黄腐酸肥料的安全性，找出良好的施肥方式，同时也为有机肥的安全施用、环境监测与保护提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验作物为小麦 (Triticum aestivum L.)，品种为金麦22号，供试土壤来自南校试验田 (117° 12’ E，36° 19’ N)，土壤理化性质为有机质 15.3 g/kg、速效钾117 mg/kg、全氮1.36 g/kg、速效磷18.5 mg/kg、pH 7.2。

试验所用黄腐酸肥为山东泉林嘉有肥料有限责任公司生产的黄腐酸肥料，肥料主要成分为20.6%的黄腐酸、有机质56.9%、水分 0.3%、有效活菌1.2%。试验所用常规肥为来自五洲丰农业科技有限公司的普通复合肥 (N-P2O5-K2O 15-10-20)。

1.2 试验设计

试验为盆栽试验，试验以农用复合肥为对照，在农用复合肥基础上增施黄腐酸肥料。采用盆钵 (规格30 cm × 50 cm) 种植小麦，每盆装土2.5 kg。精选大小一致、颗粒饱满的小麦种子，每盆播种15粒。

将农用复合肥作为基肥，与部分土壤 (约为1.9 kg) 充分混合后装盆。施入农用复合肥后，在盆钵中加入少量土壤 (约为0.1 kg) 使种子与肥料隔离开，避免烧种，最后将不同量的黄腐酸肥料与剩余土壤(约为0.5 kg) 充分混合后装盆。复合肥肥料和黄腐酸肥料的具体添加比例如表1所示，共设5个处理，每个处理设置3次重复。种植小麦后的盆钵放置在挖有浅坑的试验田内，模拟自然环境。播种后根据田间持水量的具体情况 [出芽期间，土壤含水率保持在100%，出芽后，根据天气及小麦的生长状况适量浇水使土壤含水率保持在60% (约为两天一次)]，定期清除杂草。

表1 试验各处理复合肥和腐殖酸肥料用量 (g/kg)Table 1 Application amount of compound and fulvic acid fertilizers in each treatment of the experiment

1.3 样品采集与分析

小麦种子发芽初期记录发芽率。生长40天后，用五点取样法设计采样点，在5—10 cm处采集小麦根部周围土壤，将采用抖土法取得的土壤混合均匀，放入无菌自封袋中，立即带回实验室，采集的土壤风干过2 mm筛后保存待测。

土壤细菌、真菌、放线菌数量采用稀释平板涂抹法进行测定。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，平板计数采用10-3、10-4土壤稀释液涂板；真菌采用孟加拉红培养基，真菌的计数用10-1、10-2土壤稀释液；放线菌的计数用10-3、10-4土壤稀释液涂板，培养基用高氏一号培养基[15]。土壤微生物功能多样性采用 31 种碳源的生态板 (Biolog-Eco) 进行测定分析。土壤中过氧化氢酶的测定使用高锰酸钾滴定法，脲酶的测定采用靛酚蓝比色法，酸性磷酸酶的测定使用磷酸苯二钠比色法[16]，蔗糖酶活性的测定用3,5-二硝基水杨酸比色法，即DNS试剂还原糖法。土壤微生物呼吸强度的变化采用NaOH吸收法测定。

2 结果与分析

2.1 黄腐酸肥料对小麦种子发芽率的影响

CK、NPK、NPKF2、NPKF6、NPKF10处理小麦种子发芽率依次为100%、100%、100%、97%、91%。 CK、NPK、NPKF2处理的小麦种子发芽率皆为100%，这说明低浓度的黄腐酸肥料的施用不会影响小麦种子的发芽率。但当黄腐酸施用量达到6 g/kg及以上时，种子发芽率出现降低现象，NPKF6、NPKF10处理种子发芽率减少了约3%、9%。这表明，当黄腐酸肥料的施用量较高时，会抑制小麦种子发芽，施用量越高，抑制作用越显著。试验表明一定范围内黄腐酸不会影响小麦的发芽。这与肖雪君等[17]研究的高浓度微生物肥液处理小辣椒种子后抑制种子发芽率的结果相符。

2.2 黄腐酸肥料对小麦根际土壤微生物数量的影响

图1 不同施肥处理对小麦根际土壤微生物数量的影响Fig. 1 Effects of different fertilizer treatments on microbial biomass in the wheat rhizosphere soil

由图1可以看出，各个处理细菌数量随着施肥时间的延长而增加，各处理间差异也较为明显，尤其是在第20天时，不施黄腐酸处理的细菌数量较少，施2、6、10 g/kg黄腐酸肥料的处理细菌数量明显增加。此后，随着黄腐酸肥料施用时间的延长，细菌数量均增加，且施2、6、10 g/kg黄腐酸肥料的处理细菌数量明显增加，显著高于NPK处理，40天时，施用6 g/kg黄腐酸肥料的处理细菌数量达到最高值8.47 × 107个，显著高于其他处理。

土壤中真菌数量变化如图1所示，施用黄腐酸肥料6、10 g/kg的处理在开始后第20、30、40天时，土壤中真菌的数量均显著高于不施黄腐酸肥料的处理，此后，土壤真菌数量继续增长，虽然施用黄腐酸肥料6、10 g/kg处理间的土壤真菌数量差异变小，但仍然显著高于其他处理组。这说明黄腐酸肥料在一定的时间和施用量范围内，为真菌的生长繁殖提供了适宜的环境，但是土壤中真菌的数量只随着黄腐酸肥料施用量的增加、施用时间的延长而增加。

由图1可知，整个试验周期内放线菌数量的变化各处理间差异明显。在第20、30、40天，施用黄腐酸肥料2、6、10 g/kg三个处理土壤中放线菌数量均显著高于不施黄腐酸组。在40天时，施用6 g/kg黄腐酸肥料的处理放线菌数量达到最高值。

微生物是土壤生命有机体的重要组成部分，也是土壤活性养分的暂时储存库，微生物数量的变化能够充分反映温度、水分、养分以及施肥等农业措施对土壤环境的影响。从不同量的黄腐酸肥料对这“三大菌”的影响趋势规律上看，基本上随黄腐酸肥料施用量的增加其促进程度也增强，也就是说，施肥可以增加土壤中的微生物数量。在本研究中，随施肥时间的延长，各个处理的微生物数量都有不同程度的增长。由此可以看出，黄腐酸肥料的施用不仅可以增加土壤中营养元素含量，为土壤微生物提供了充足的矿物养分，可促进微生物的生长和繁殖，增加土壤微生物数量，同时黄腐酸肥料的施用也增加了土壤中的植物残留和根系分泌物的种类和数量，为土壤中微生物提供了更适宜的栖息环境，从而促进了土壤三大菌的生长和繁殖。与此同时，黄腐酸肥料的施用也在一定程度上增加了土壤中有机质和有效养分的含量，为土壤微生物尤其是异养微生物的生长和代谢提供了能源，从而有利于微生物的生长和繁殖[18]。

2.3 黄腐酸肥料对小麦根际土壤酶活性的影响

由图2A可知，与不施黄腐酸肥料的处理相比，施用黄腐酸肥料2、6、10 g/kg的处理土壤脲酶活性均显著增加，但施用黄腐酸肥料6、10 g/kg的两个处理间脲酶活性差异不显著。

由图2B可以看出，施用黄腐酸肥料2、6、10 g/kg的处理均显著促进了土壤中酸性磷酸酶的活性，但三个处理间差异不显著，施用黄腐酸肥料6 g/kg的处理比施用黄腐酸肥料10 g/kg的处理土壤中酸性磷酸酶活性略有减少，为1.23 mg/(g·d)。说明施用黄腐酸肥料有利于植物根系在低磷环境下分泌酸性磷酸酶的活性增加，同时又能够促进土壤中的有机磷化合物的代谢和再利用，从而提高土壤中的有机磷有效性，有利于植物生长。

从图2C可以看出，施用黄腐酸肥料2、6、10 g/kg的处理间差异较小，但都比NPK处理酶活性增加，且随着黄腐酸肥料施用量的增加，过氧化氢酶活性也随之增加，施用黄腐酸肥料2、6、10 g/kg处理的土壤中过氧化氢酶活性均高于NPK处理，且当黄腐酸肥料施用量达到10 g/kg时，过氧化氢酶活性显著高于其他处理，为10.87 mg/(g·d)，远远高于只施用复合肥的处理。说明黄腐酸肥料的施用对小麦根际土壤具有显著影响，适量的黄腐酸肥料可以有效提高土壤中的过氧化氢酶活性，从而提高土壤腐殖质化强度，加快土壤有机质化速度。

图2 不同施肥处理对小麦根际土壤酶活性的影响Fig. 2 Effects of different fertilizer treatments on soil enzyme activity in the wheat rhizosphere soil

从图2D可以看出不同施肥水平对土壤蔗糖酶的影响不同。在施用了黄腐酸肥料后，土壤中蔗糖酶的活性明显增加。与前三种酶相似，且施用黄腐酸肥料2、6、10 g/kg的处理蔗糖酶的活性均高于NPK处理和CK，随着黄腐酸肥料施用量的增加，土壤中蔗糖酶的活性也略有增加，当黄腐酸肥料施用量达到10 g/kg时，蔗糖酶活性达到最大值，为10.95 mg/(g·d)。说明施用适量的黄腐酸肥料有利于提高土壤蔗糖酶活性，增加土壤中易溶性营养物质，从而提高土壤肥力，促进小麦生长。

2.4 黄腐酸肥料对小麦根际土壤微生物功能多样性的影响

图3可以看出，培养24小时的不同处理下的小麦根际土壤微生物在Biolog-Eco平板上的平均颜色变化率 (AWCD) 没有产生明显差异；第48小时时施用黄腐酸肥料2、6、10 g/kg的处理与只施用复合肥的NPK相比较均增长，施用黄腐酸肥料2、6 g/kg的处理之间差异并不明显；第72小时，施用黄腐酸肥料2、6、10 g/kg的处理与NPK处理相比较均产生了大幅度增长，施用黄腐酸肥料6、10 g/kg的处理增长较NPK处理更明显；第96小时和第120小时时施用黄腐酸肥料2、6、10 g/kg的处理与NPK处理相比较，均产生了大幅度增长，且施加黄腐酸肥料的处理比只施了常规肥的处理，平均颜色变化率增长幅度更大，表明微生物的整体代谢活性逐渐增强；除了第24小时和第48小时外，其余各组对照均显示平均颜色变化率 (AWCD) 随着黄腐酸肥料施用量的增加而增加，且各浓度处理之间存在较大差异。随着时间的增长，同一处理，小麦根际土壤微生物在Biolog-Eco平板上的平均颜色变化率增加。说明施用黄腐酸肥料能有效增加小麦根系活性，促进分泌物增加，促进根际土壤微生物的代谢活性，增强根际微生物利用碳源的能力。

图3 不同施肥处理小麦根际土壤微生物Biolog-eco平板平均颜色变化率 (AWCD)、群落多样性指数及呼吸强度Fig. 3 Average well color development (AWCD), diversity indices and respiration intensity of microbes in the wheat rhizosphere soil[注（Note）：XE—Shannon均匀度, Shannon evenness；XH—Shannon指数, Shannon index；XU—McIntosh指数, McIntosh index.]

由图3可知，各个处理的小麦根际土壤微生物群落的Shannon均匀度无明显差异，但Shannon均匀度随着黄腐酸肥料施用量的增加而增加，表明在一定的浓度范围内施用黄腐酸肥料能提高小麦根际土壤微生物群落的均匀度。施用黄腐酸肥料2、6、10 g/kg的处理与只施用复合肥的NPK处理相比，小麦根际土壤微生物群落的Shannon指数增幅明显，施用黄腐酸肥料2、6、10 g/kg的处理Shannon指数均明显高于NPK处理，而且Shannon指数随着黄腐酸肥料施用量的增加而增加，表明在一定的浓度范围内黄腐酸肥料能提高小麦根际土壤微生物群落物种的丰富度，施用黄腐酸肥料对土壤微生物的多样性有显著影响；施用黄腐酸肥料2、6、10 g/kg处理的McIntosh指数明显高于NPK处理，且NPKF2、NPKF6处理之间无明显差异，但McIntosh指数总体上随着黄腐酸施用量的增加而增加，表明在一定的浓度范围内黄腐酸肥料能提高小麦根际土壤微生物群落的物种多样性。

施用黄腐酸肥料能提高小麦根际土壤微生物功能的多样性，且随时间的延长，土壤微生物的总体活性呈增长的趋势，根际土壤微生物群落的丰富度、物种的均匀度和群落的多样性都相应的增加。

相同试验条件下，三个多样性指数的变化规律基本一致，根际土壤微生物群落的Shannon均匀度、Shannon指数、McIntosh指数总体上随着黄腐酸肥料施用量的增加而增大。这可能是因为施用黄腐酸肥料一段时间后，肥料中含有的有益菌群逐渐适应了土壤环境并大量繁殖，随着小麦生长周期的延长，各处理的土壤微生物McIntosh指数逐渐增大[19]。施用黄腐酸处理的McIntosh指数明显高于其他处理，表明黄腐酸肥料的施用可提高物种的均匀度，使系统更加稳定。

通过图3可以看出，施用黄腐酸肥料2、6、10 g/kg处理的小麦根际土壤微生物呼吸强度明显高于NPK处理，且呼吸强度随着黄腐酸肥料施用量的增加而增大，在施用量达到10 g/kg时，微生物呼吸强度达到最大值，为O228.79 mmol/(g·h)，说明了施用的黄腐酸肥料在一定的浓度范围内能提高小麦根际土壤微生物群落呼吸强度。NPK处理呼吸强度较其他处理小，为O220.61 mmol/(g·h)，可能是因为仅施常规肥情况下，土壤中微生物活动受到抑制，进而影响了微生物的呼吸作用。

总的来说，施用常规肥和黄腐酸肥料后，丰富了土壤中N、P、K及其他营养元素的含量，促进了微生物的生长繁殖，进而增强了其自身的生命活动，从而增强了微生物的呼吸作用，因为微生物需要依靠呼吸作用产生的能量来维持自身的生活。

3 讨论

本研究旨在了解在短期种植的小麦土壤中施入不同量的黄腐酸肥料对土壤微生物和土壤酶活性的影响，而土壤酶活性、微生物数量可以从不同角度表征土壤肥力水平。

土壤微生物参与有机质矿化、养分循环、毒物分解和腐殖质合成等多种土壤生化反应，与土壤肥力密切相关[20-22]，对维系土壤健康极为重要[23-24]。本试验采用稀释平板计数法和Biolog-Eco微平板相结合的方法研究了不同施肥处理下小麦根际微生物的变化。结果表明，施用黄腐酸肥料后，三大菌的数量随时间的延长，都有明显的增加趋势，最后的数量增长趋势为 NPKF6 ＞ NPKF10 ＞ NPKF2 ＞ NPK ＞CK(图1)，说明施用黄腐酸肥料促进了细菌、真菌、放线菌的繁殖生长，提高根际微生物的多样性。这与前人的研究结果一致[25]。在不施任何肥料的条件下(CK组)，细菌、真菌、放线菌主要是靠小麦根系的生命活动和代谢活动所产生的化合物和土壤中原有的养分来维持生长的，然而小麦的萌芽和生长也需要养分，土壤中的养分含量有限，因此土壤中的微生物量会减少[26]。而施用黄腐酸肥料后，其中含有的微生物菌群促进了养分的转化，为土壤中微生物的生长繁殖提供了大量的养分和能量，从而使土壤中三大菌的数量显著增加，同时土壤中的细菌、放线菌数量的明显增加促进了土壤和肥料中有机物质转化，为微生物的代谢作用提供了必要的营养元素[27]。复合肥和黄腐酸肥料的配合施用，更能促使细菌、真菌、放线菌的数量增加，并使其成为根际土壤的优势菌群，提高土壤微生物的数量多样性，使根际微生物区系向健康的方向发展。

土壤酶是土壤中植物根系分泌、动植物残体分解和土壤微生物代谢的产物，可以直接参与土壤腐殖质的分解与合成，以及土壤碳、氮等养分的转化[28]。张静等[29]研究发现，施用生物有机肥后，土壤蔗糖酶、脲酶和酸性磷酸酶活性均高于对照。本研究的结果与此一致，施用黄腐酸肥料后，各个处理脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶、蔗糖酶的活性均出现显著增加，且NPKF10的酸性磷酸酶、过氧化氢酶的活性增加最为显著。在本试验条件下，施用的黄腐酸肥料增加了土壤中的有机质，为过氧化氢酶发挥作用提供了适宜的场所和条件，使试验土壤过氧化氢酶的活性显著提高。试验土壤中蔗糖酶显著增加，是由于黄腐酸肥料中的有机物料增加了土壤有机质，提供了充足的酶促反应的基质，加快了有机碳的转化[30-31]，刺激了蔗糖酶活性的升高。在施用不同量黄腐酸肥料40天后，土壤中酸性磷酸酶、脲酶的活性随施用量的增加，呈现较稳定的增长趋势，其中脲酶活性的增长趋势为NPKF10 ＞ NPKF6 ＞NPKF2 ＞ NPK ＞ CK(图 2 A)，这与田小明等[32]的研究一致。说明有机质含量高的黄腐酸肥料对脲酶和酸性磷酸酶的活性提高最为有效，而单施复合肥的处理土壤脲酶和酸性磷酸酶活性的增加并不显著，这说明施用的黄腐酸肥料有效改善了土壤微生物的生活环境，为微生物的生命活动提供了大量的养分和能量[33]，促使微生物分泌更多的脲酶，同时施用黄腐酸肥料为脲酶的酶促反应提供了大量的基质，使其活性增强，从而为处于低磷环境中的小麦提供了大量的氮素和磷素[34-35]，有利于其生命活动的进行。施用黄腐酸肥料处理的根际土壤中四种酶活性显著增加，这是植物根系分泌土壤酶和微生物数量增加的结果。

土壤微生物群落AWCD值反映了土壤微生物利用碳源的能力和微生物代谢活性的大小，其值越高，则表示土壤微生物代谢活性越高[36]。土壤微生物Shannon指数反映了微生物群落物种变化度和差异度，McIntosh指数是群落物种均一性的度量[37]。本研究结果表明，施用黄腐酸肥料处理在短期内可提高土壤微生物AWCD值和McIntosh指数，NPKF10处理的效果最佳，表明NPKF10处理土壤微生物的整体代谢能力有所增加，物种多样性和均匀度也有增加。刘艳霞等[38]研究也表明，土壤中施入生物有机肥处理的土壤微生物Shannon指数、Simpson指数和Mclntosh指数均高于CK。本研究结果与之相似。随着施用黄腐酸肥料时间的增加，土壤微生物呼吸作用增强，代谢活性也随之增强，而且不同程度的增加了土壤有机质的分解，为微生物生长繁殖提供了大量的营养物质，进而促进了微生物的功能发展[39]。

因此，黄腐酸肥料和复合肥配合施用提高了土壤微生物的整体代谢能力，有效改善了小麦根际土壤的生态环境，从而促进多种微生物的生长繁殖，丰富种群，增加密度。黄腐酸肥料中的有益菌群可以活化土壤矿质养分，提高小麦对多种营养元素的吸收和利用，促进其根系生长，而根系可以向根际土壤分泌更多的土壤酶，并聚集大量的微生物，同时为微生物的代谢活动提供充足的营养物质，而微生物的死亡和根部细胞脱落都会促使细胞内的相关酶进入土壤，增加土壤酶活性[40-42]。

4 结论

施用黄腐酸肥料可以改善土壤营养环境，为土壤微生物的生命活动提供充足的养分和能源，增强呼吸作用，从而促进微生物生长繁殖，丰富种群，增加密度，有效改善土壤微生物群落功能，并且在短期内可以提高土壤蔗糖酶、过氧化氢酶、脲酶和酸性磷酸酶活性。

黄腐酸肥料用量超过10 g/kg会对小麦种子的发芽率产生影响，产生“烧苗”现象。因此，综合考虑，黄腐酸肥料的最佳施用量为6 g/kg。

致谢：山东农业大学泉林黄腐酸肥料工程实验室开放基金 (QL2016-25) 和水利土木工程学院孙甲玉、刘凯传、陈国栋等同学在样品测试与分析中给予帮助，特此感谢！