阻断TNF-α可改善苯并芘诱导的肺慢性炎症

罗贤强，陈如章，高基民

(温州医科大学 检验医学院 生命科学学院，浙江 温州 325006)

肺癌是发病率与死亡率最高的恶性肿瘤[1]。香烟烟雾中存在多种致癌物，其中苯并芘是最为明确且典型的完全致癌物，已被国际癌症研究机构归入致癌物的第一组[2]。苯并芘在环境中分布广泛，主要存在于煤炭、石油等矿石燃料不完全燃烧产生的烟气和香烟烟雾中，人类每天通过吸烟或被污染的空气、食物、水等途径摄入一定量的苯并芘[2]。

苯并芘常用于在动物模型中诱发肺相关肿瘤，而这些肿瘤与人原发性肺癌在组织病理学特征上极为相似[3]。实验动物注射苯并芘的剂量与吸烟者一生中所暴露的苯并芘剂量相当[4]，在苯并芘给药后相对较短时间内，随着年龄的增长，小鼠自发性长出大量肿瘤[5]。因此，小鼠模型已广泛用于苯并芘致肺癌作用及其干预研究[6]。

癌症的发生发展是多个阶段和步骤的过程[7]。研究表明，肺慢性炎症是环境致癌物导致肺癌发生发展的重要因素[8-9]。苯并芘可通过氧化应激等诱导肺持续高表达肿瘤坏死因子α(TNF-α)，促使肺部慢性炎症的形成与维持，进而导致肺癌[2,10]。因此，该研究拟在苯并芘诱导的肺慢性炎症阶段通过阻断TNF-α的表达，来改善肺局部炎症微环境，从而达到预防甚至延缓肺癌的发生发展的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

6～8周龄SPF级雄性昆明小鼠购于北京联合利华，引进饲养在温州医科大学动物实验中心，体重(60±5)g。苯并芘、玉米油购自Sigma公司，流式抗体Pacifice Blue anti-mouse CD45、APC anti-mouse CD11b、PE-cy7 anti-mouse F4/80、PE anti-mouse CD86等购自BioLegend公司，小鼠组织细胞消化试剂Collagenase IV、DNase I购自Sigma公司，β-巯基乙醇、IMDM培养基、胎牛血清购自Gibco公司。治疗用TNF-α拮抗剂为安佰诺，购自浙江海正药业。

1.2 方法

1.2.1 模型构建

将小鼠随机分为苯并芘暴露组与溶剂(玉米油)对照组。处理组小鼠经右侧胸腔肋间隙注射苯并芘(苯并芘溶于玉米油)，每周注射1次，每次1 mg·只-1，连续注射4周。溶剂对照组小鼠注射相同剂量玉米油，每周注射1次，连续注射4周。

1.2.2 动物分组及给药

在小鼠苯并芘暴露第31天，将暴露小鼠随机分成2组，每组10只。抗TNF-α(anti-TNFα)治疗组小鼠经腹腔给药0.5 mg TNF-α拮抗剂，连续注射1周；治疗对照组小鼠腹腔注射等质量PBS，连续注射1周。在苯并芘暴露180 d后处死小鼠，称重并采样以供检测。

1.3 样品测定

1.3.1 小鼠肺组织形态观察

将小鼠肺组织取出，10%中性福尔马林固定，石膏包埋，连续切片，HE染色，光镜下观察组织形态变化，比较炎症细胞浸润程度及肿瘤细胞浸润情况。

1.3.2 小鼠肺组织巨噬细胞及共刺激分子表达

将小鼠肺组织取出，研磨消化制成单细胞悬液，200目尼龙膜过滤，流式抗体染色，4 ℃避光孵育30 min，IMDM培养基清洗3次，用含细胞死活染料7-AAD的2% FBS buffer重悬，流式上机检测。

1.4 数据分析

流式细胞仪检测数据用Flowjo软件分析，用GraphPad Prism 7.0进行统计学差异分析。所有数据均以均值±标准差表示，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

2 结果与分析

2.1 小鼠肺组织形态

如图1所示，PBS治疗对照组小鼠肺组织结构内多量炎性细胞浸润并出现腺样结构；抗-TNF-α处理小鼠肺部炎症细胞浸润明显减少；溶剂对照组小鼠肺组织结构清晰，无明显改变。

A—溶剂对照组；B—PBS治疗对照组；C—抗-TNF-α处理组。图1 小鼠肺组织切片(400×)

2.2 小鼠肺组织巨噬细胞浸润情况

大多数肿瘤的发生与迁延不愈的炎症紧密相关，局部慢性炎症微环境能促进肿瘤进展和转移[11]。如图2所示，苯并芘暴露小鼠肺部巨噬细胞浸润明显增加。抗TNF-α治疗可减少其肺部浸润，但尚未达到统计学差异(图3)，可能是由于检测样本是整个右肺消化成的单个细胞样本，无法体现局部炎症微小差异。

A—溶剂对照组；B—PBS治疗对照组；C—抗-TNF-α处理组。图2 不同处理小鼠肺组织巨噬细胞的流式散点图

图3 不同处理小鼠肺部巨噬细胞水平

2.3 小鼠肺组织巨噬细胞共刺激分子表达水平

炎症不仅上调APC细胞膜上MHCⅡ分子的表达，并能稳定膜上MHCⅡ-抗原复合物[12-13]。如图4所示，苯并芘暴露小鼠肺部CD86阳性与CD86/MHCⅡ双阳巨噬细胞比例均显著增高，抗TNF-α治疗能不同程度降低巨噬细胞CD86与MHCⅡ的表达，表明抗TNF-α治疗减少了肺部炎症刺激因子的产生，改善了肺部炎症微环境。

3 讨论

介导促进慢性炎症的因素同时可以促进肿瘤的发生发展[7,13]。炎症是一个复杂的过程，涉及免疫和非免疫细胞之间的相互作用，慢性炎症为癌症提供了重要的致癌环境[13]。苯并芘是香烟中最为明确和典型的重要致肺癌化合物。苯并芘易被吸收，能通过呼吸道、口腔和皮肤等途径进入人体，是吸烟及大气污染的主要致癌物之一[2]。苯并芘可以直接作用于实验动物(包括小鼠、大鼠)，直观地展现肿瘤发生发展过程中出现的各种细胞分子事件[6]。

A—各处理小鼠肺部CD86阳性巨噬细胞散点图与CD86阳性巨噬细胞占比；B—各处理小鼠CD86/MHCⅡ双阳性巨噬细胞流式散点图与CD86/MHCⅡ双阳巨噬细胞占比。图4 不同处理小鼠肺部炎症细胞共刺激分子表达水平

TNF-α表达持续上调对苯并芘诱导的肺慢性炎症形成与维持，以及肺癌的发生发展具有重要的作用[2]。TNF-α是调节炎症的主要因子，也是确保组织稳态的关键参与者[14]。已有研究发现，TNF拮抗剂可调节炎性反应[15]。本研究中，与溶剂对照组小鼠相比，苯并芘暴露小鼠肺部巨噬细胞浸润程度显著增加，而经抗TNF-α治疗后肺部巨噬细胞浸润程度整体有所下降。在炎症因子的刺激下，炎症细胞表面共刺激分子CD86与MHCⅡ类分子表达上调[16-17]。苯并芘暴露小鼠与正常小鼠相比，肺部巨噬细胞MHCⅡ与CD86表达水平上调，经抗TNF-α治疗后，细胞表面MHCⅡ与CD86表达不同程度地降低。抗TNF-α治疗可改善苯并芘诱导的肺局部炎症状况，并且延缓了肺组织病理改变。以上研究结果为预防环境致癌物暴露诱发的肺癌提供了初步研究基础。