云南主栽核桃品种对Phyllosticta juglandis叶斑病的抗性评价

贺占雪，泽桑梓，杨斌，赵宁*

(1.西南林业大学，云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224； 2.云南省林业有害生物防治检疫局，云南 昆明 650051)

核桃(JuglansregiaL.)是重要坚果和木本油料树种[1]，同时也是重要的经济生态树种之一，与榛子、扁桃和腰果并称为世界著名的“四大干果”[2]，具有丰富的营养价值和良好的医疗保健效果，深受人们喜爱。随着经济和社会的发展，核桃产业的经济价值不断突显，受到外界关注度日益增长，提高核桃的丰产性、早实性、坚果品质、抗逆性、抗病性和砧木改良已成为我国核桃育种的目标[3]。近年来，云南核桃的种植面积不断扩大，在全国核桃生产中占有重要地位。但随着种植面积的增大，核桃种质资源交流的频繁进行和核桃产业的迅速发展，病虫害对核桃产业发展的影响也逐渐加深。相关研究数据显示，云南核桃种植中有害生物的危害面积超过6.7万hm2，其中病害面积高达4.4万hm2。核桃病害直接影响了核桃的质量、产量和农户的经济收入。本研究对云南主栽的31个核桃品种对叶斑病抗性进行初步测定和评估，以期为生产中绿色防治提供科学依据，并为今后核桃抗病品种的选育和核桃产业的健康发展提供参考。

叶点霉属真菌危害植物叶片、茎和根等部位，是农作物、林木、经济作物和观赏植物的主要病原菌[4-5]，可引起多种植物的叶斑病[6-10]。该病菌主要侵染核桃叶片，发病初期在叶基部和叶脉基部形成圆形病斑，随着感病程度逐渐加强，叶片会出现退绿、脱落等现象[11-12]，病情严重时，造成植株早期落叶，花、果腐烂，严重影响核桃产量。秦恩华等[13]对栀子病叶分离鉴定得出，引起栀子叶斑病的病原菌为Phyllostictagardeniicola；练启仙等[14]报道，叶点霉属真菌PhyllostictaglycinesThum.是引起砂仁叶斑病的主要病原菌；张格杰等[15]对大花黄牡丹叶斑病病原分离鉴定，得到引起该病的病原菌为Phyllostictacommonsii；王晓梅等[16]对桂花叶斑病病叶进行病原分离鉴定，得出病原菌为PhyllostictaghaesembillaeKoorders。

云南地形和气候特殊多变，核桃叶部真菌病害也有多种，项目组前期研究发现，Phyllostictajuglandis(DC.)Sacc是引起核桃叶斑病病害的病原菌。目前，国内外对核桃叶斑病的防治主要采用物理剪除、化学防治和培育抗病品种等3种方法，但物理剪除和化学防治均存在弊端，因此，培育抗病品种是防治叶斑病经济有效的方法。

抗病性鉴定是抗病育种工作的重要环节。本试验采用室内病原离体接种的方法，对云南主栽的31个核桃品种对叶斑病菌Phyllostictajuglandis的抗性进行了初步测定和评估，在初步筛选出抗性品种的基础上，分析31个核桃品种的不同抗性差异，并采用病害分级和聚类分析的方法，对核桃的抗感病性进行综合评价，筛选出抗病品种和综合性状优良的核桃品种，为云南核桃抗病优良品种的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

接种材料叶片采自大理白族自治州林业科学研究所核桃种质资源采集圃的大泡核桃、青皮大泡、小泡核桃、纸皮核桃、细皮核桃、小胖若核桃、三台核桃、方壳核桃、娘青核桃、大木瓜核桃、扎343、新翠丰、新新2号、新早丰、小圆果、圆菠萝、桐子果、夹棉大麻、夹棉小麻、漾杂1号、漾杂2号、漾杂3号、漾江1号、云新云林、云新高原、云新90301、云新90303、云新90306、大包壳、大尖嘴、四方果等不同核桃品种的嫩叶。

参照赵梓岑等[17]获取核桃炭疽病病原菌的方法，得到试验所需核桃叶斑病胡桃叶点霉属病原菌(Phyllostictajuglandis(DC.)Sacc)。

1.2 方法

1.2.1 菌株培育及接种材料处理

选取致病性测定过程中致病能力较强的胡桃叶点霉菌株，在用PDA培养基在25 ℃条件下培养5 d后，选择菌落中边缘菌丝生长能力较强的地方，用3 mm打孔器取菌饼，对照采用无菌PDA菌饼。

按规格摘取宽4～5 cm、长10～12 cm核桃嫩叶，先用自来水清洗表面的灰尘，再用75%酒精表面消毒，然后用无菌水冲洗3次，晾干水分，使用石英砂在叶片表面固定部位摩擦，造成轻微伤口，备用。

1.2.2 离体接种

在无菌操作台上进行离体接种，每种材料设10个重复和1个对照。将PDA上活化后的胡桃叶点霉病菌菌饼反扣在处理好的核桃嫩叶伤口处，在铺有湿润滤纸的培养皿内进行培养，对照接种无菌PDA。接种后置于25 ℃、相对湿度90%的恒温恒湿生化培养室内黑暗培养，每天观察记录接种叶片病斑的发展情况，于接种后3 d开始，用游标卡尺对发病部位进行纵横径测量，取均值计算其病斑面积。

1.2.3 抗性评价

根据系统聚类分析结果，选择最适聚类距离为分割点，得出最适聚类分析结果，以此为依据，并结合病害分级标准，对云南31个主栽核桃品种抗Phyllostictajuglandis(DC.)Sacc进行分析评价。

病害分级标准参照张小艳等[18]对枇杷叶斑病研究的病斑分级标准，有修改。1级，病斑面积占叶面积的比率<5%；2级，病斑面积占叶面积的比率5%～10%；3级，病斑面积占叶面积的比率10%～20%；4级，病斑面积占叶面积的比率20%～50%；5级，病斑面积占叶面积的比率≥50%。

1.2.4 数据处理与分析

采用SPSS 23.0数据分析软件进行相关数据的聚类分析，将病斑面积均值进行对数转换、标准化转换等6种处理，聚类距离采用欧式距离，聚类方法采用组间联系、组内联系、最近邻元素、最远邻元素、质心聚类、中位数聚类、瓦尔德法等7种方法，采用不同的聚类分析方法和聚类距离分别组合进行数据分析，依据接种后的病斑面积均值结合聚类分析结果，筛选出与此次试验最相符的聚类分析方法，并以谱系图的形式展现聚类结果。

2 结果与分析

2.1 接种胡桃叶点霉后的病斑大小差异

31个品种的核桃嫩叶接种胡桃叶点霉5 d后的病斑面积见表1。不同品种对胡桃叶点霉抗性能力存在差异。31个品种的核桃嫩叶接种胡桃叶点霉后，纸皮核桃、云新高原2个品种均未发病；夹棉大麻病斑面积最小，为0.6 mm2；圆菠萝病斑面积最大，为1 175.00 mm2。

根据接种后病斑大小的次数分布图(图1)可以看出，31个核桃品种中，平均病斑面积为0～200 mm2有28个品种，平均病斑面积为200～400 mm2的仅有扎343，平均病斑面积为800～1 000 mm2的仅有新早丰，平均病斑面积为1 000～1 200 mm2的仅有圆菠萝。

2.2 接种胡桃叶点霉后的抗性分级

对接种病原菌后的病斑面积数据进行聚类分析，以欧式距离2.5作为聚类分割点，将31个核桃品种分为5类(图2)。第1类有16个抗病品种，包括云新高原、纸皮核桃、夹棉大麻、小泡核桃、漾杂1号、细皮核桃、大木瓜核桃、娘青核桃、大包壳、桐子果、四方果、夹棉小麻、青皮大泡、新翠丰、大泡核桃、新新2号；第2类有7个中抗品种，包括云新云林、云新90303、小胖若核桃、方壳核桃、漾杂2号、大尖嘴、小圆果；第3类有6个中感品种，包括漾杂3号、云新90306、三台核桃、云新90301、漾江1号、扎343；第4类仅有1个感病品种新早丰；第5类亦仅有1个高感品种圆菠萝。

表1 不同核桃品种接种胡桃叶点霉后嫩叶病斑的大小

图1 接种胡桃叶点霉后不同核桃品种病斑 面积大小的次数分布

图2 不同核桃品种对胡桃叶点霉抗病性的 聚类分析

由病害分级标准结合聚类分析结果(表2)，得出云南主栽的31个核桃抗病性分级结果，其中抗性品种16个(占总数的51.6%)，中抗品种7个(22.6%)，中感品种6个(19.4%)，感病和高感各1个(3.2%)。

表2 不同核桃品种接种胡桃叶点霉后的抗病性反应

3 小结与讨论

核桃抗病育种是一项复杂的工作，品种的抗病性不仅取决于自身的内在条件，亦受各种外界条件的影响[19-20]。抗病性评价有利于快速筛选出抗病品种，为育种工作提供理论依据[21]。室内离体接种评价是抗性评价的重要手段之一，而离体叶片接种是操作简便、快速、有效的病害评价方法。张子君等[22]采用叶片离体接种的方法对不同品种番茄进行早疫病抗性评价；刘莉等[23]采用叶片和枝条离体接种的方法对17个核桃品种进行抗病性评价；余仲东等[24]采用室内针刺接种的方法对核桃溃疡病进行抗病性评价。云南地形条件特殊，地势复杂，核桃栽培模式多样化，加之管理缺陷等因素，核桃种植受叶斑病的影响日益严重[19]。

我国核桃抗病育种起步较晚，本次研究结果表明，云南主栽的31个核桃品种对Phyllostictajuglandis的抗病性存在差异。将31个品种的抗病性分为5类，包括16个抗病品种、7个中抗品种、6个中感品种、1个感病品种和1个高感品种，其中，抗病品种占51.6%，中抗占22.6%，中感占19.4%，感病和高感占6.5%。本次试验通过室内离体接种对云南主栽的31个核桃品种进行抗性评价，筛选到抗性品种23个，可为后续云南核桃园改造和新建提供品种选育参考。