axin和METTL14在胃癌组织中的表达情况及其与患者临床特征的关系

华勇，张秉丽，李有连

青海仁济医院消化科，西宁 810000

胃癌是中国较常见的消化道恶性肿瘤，发病率居各种恶性肿瘤第5位，病死率居各种恶性肿瘤第4位[1]。其发病年龄一般在50岁，但近年来发现，胃癌的发病人群正趋于年轻化。胃癌的发病原因多样，目前国内外的医学工作者尚未明确其发病机制。胃癌发病隐匿，早期症状往往被患者误认为是消化道溃疡，且常见的计算机体层摄影（CT）、血常规等检查方法较难发现，一旦发现往往处于晚期，丧失了手术治疗的机会，给治疗和康复带来极大困难[2-3]。传统治疗胃癌的方法是手术、放疗和化疗。轴抑制剂（axis inhibitor，axin）是广泛存在于生物体内的一种支架蛋白，是Wnt信号通路中非常重要的调控因子[4]。axin在恶性肿瘤细胞的分化、增殖和迁移过程中发挥重要作用。近年来的研究发现，当axin基因表达出现异常时，会调节靶基因的表达，从而影响胃部细胞的正常生长，导致胃部恶性肿瘤的形成。已有研究报道，axin基因异常表达可促进肺癌、结肠癌等恶性肿瘤形成[5]。甲基转移酶样蛋白14（methyltransferase like 14，METTL14）是一种非常重要的甲基转移酶，可调控mRNA水平，与肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡密切相关[6]。近年来的研究发现，METTL14主要调控细胞的分化、增殖和凋亡，与胃癌的形成密切相关[7]。本研究分析胃癌组织、正常胃黏膜组织及癌前病变组织中axin与METTL14蛋白的表达情况，旨在为胃癌的诊断和治疗提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年7月至2017年7月于青海仁济医院接受手术治疗的胃癌患者。纳入标准：①经病理检查确诊为胃癌；②入院前未接受过化疗、放疗等其他治疗；③临床资料完整。排除标准：①合并高血压等慢性疾病；②合并心、肝、肾功能不全等疾病；③合并精神疾病。根据纳入和排除标准，本研究共纳入79例胃癌患者，作为观察组。其中，男49例，女30例；年龄30～75岁；肿瘤部位：胃窦51例，胃体16例，胃底贲门12例；临床分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期25例，Ⅲ期35例，Ⅳ期8例；淋巴结转移30例，无淋巴结转移49例。选择同期于青海仁济医院进行胃镜检查确诊为胃癌癌前病变的31例患者作为对照组，其中男22例，女9例；年龄29～76岁；病变类型：上皮内瘤变16例，肠上皮生化15例。两组患者的性别、年龄、体重指数和病程比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1），具有可比性。收集胃癌患者的胃癌组织和正常胃黏膜组织（距肿瘤边缘＞5 cm）标本各79例，收集癌前病变患者的癌前病变组织标本31例。

表1 两组患者的临床特征

1.2 免疫组织化学染色方法

采用免疫组织化学染色法检测各组织中的axin和METTL14蛋白的表达情况：将采集的组织样本切取厚度为0.3 cm左右的样本块，放入浓度为4%的多聚甲醛中，10 h后取出，蒸馏水清洗15 min，80%、90%、95%、100%的乙醇脱水，二甲苯透明2次，每次20 min，然后用57℃石蜡包埋，连续切取厚度为4µm的切片，置于载玻片上，漂烘仪中脱蜡30 min，然后使用100%乙醇脱去二甲苯，使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗 3次。将蒸馏水和30%过氧化氢按照10∶1配制，将切片置于混合液中，10 min后取出，蒸馏水清洗3次，然后放入柠檬酸缓冲液中，加热至100℃，15 min后冷却至室温，使用PBS冲洗3次，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）试剂盒A液封闭切片，10 min后弃去A液，加入兔抗人axin与METTL14多克隆抗体，对照则加入PBS缓冲液，4℃过夜，然后PBS冲洗3次，每次5 min，每张切片均滴加SP试剂盒B液，孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加SP试剂盒C液，孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加显色液后对切片进行复染、透明、封片。

1.3 免疫组织化学染色结果判定标准

由本院2名具有10年以上经验的病理科医师采用双盲法进行阅片。METTL14阳性颗粒呈黄色，主要定位于细胞核；axin阳性颗粒呈黄色，主要定位于细胞质，少量表达于细胞核。对每例标本随机选取10个高倍（×400）视野，每个视野计数100个细胞。染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。阳性细胞所占百分比评分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分。染色强度与阳性细胞所占百分比评分相加，≥2分为阳性，＜2分为阴性[7]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；相关性分析采用Spearman秩相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中axin蛋白表达情况的比较

正常胃黏膜组织中axin蛋白的阳性表达率为75.9%（60/79），高于胃癌组织的51.9%（41/79）和癌前病变组织的35.5%（11/31），差异均有统计学意义（χ2=4.367、6.588，P＜0.05）；胃癌组织和癌前病变组织中axin蛋白的阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（图1）

图1 不同组织中axin 蛋白的表达情况（免疫组织化学染色，×400）

2.2 不同组织中METTL14蛋白表达情况的比较

正常胃黏膜组织中METTL14蛋白的阳性表达率为83.5%（66/79），高于胃癌组织的35.4%（28/79）和癌前病变组织的61.3%（19/31），差异均有统计学意义（χ2=7.263，5.427，P＜0.05）；胃癌组织中METTL14蛋白的阳性表达率低于癌前病变组织，差异有统计学意义（χ2=4.521，P＜0.05）。（图2）

图2 不同组织中METTL14蛋白的表达情况（免疫组织化学染色，×400）

2.3 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中axin和METTL14蛋白表达情况的比较

不同性别、年龄、肿瘤部位的胃癌患者胃癌组织中axin和METTL14蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移、中+高分化的胃癌患者胃癌组织中axin蛋白的阳性表达率均高于临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、低分化的患者，差异均有统计学意义（χ2=6.124、5.697、6.134，P＜0.05）；临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移、中+高分化的胃癌患者胃癌组织中METTL14蛋白的阳性表达率均高于临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、低分化的患者，差异均有统计学意义（χ2=4.598、4.190、5.893，P＜0.05）。（表2）

2.4 METTL14与axin 蛋白表达的相关性分析

79例胃癌组织中，METTL14与axin共阳性表达24例，共阴性表达14例，且METTL14和axin表达呈正相关（r=0.569，P＜0.01）。31例癌前病变组织中，METTL14与axin共阳性表达9例，共阴性表达10例，且METTL14和axin表达呈正相关（r=0.372，P＜0.01）。

表2 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中axin和METTL14蛋白的表达情况（n=79）

3 讨论

胃癌是中国常见的消化系统恶性肿瘤，早期发现较为困难，一般在偶然检查中发现，往往已处于晚期，给患者及家属带来巨大的精神压力和经济负担[8]。胃癌的发病原因复杂，涉及抑癌基因和癌基因的表达及细胞生物学改变等[9-10]。近年来许多研究者致力于研究胃癌的发病原因、机制及其治疗方法，但结果仍不理想，因此，尽快准确地诊断和治疗胃癌具有重要意义[11-13]。axin基因是研究人员在研究小鼠融合基因时发现的抑癌基因，具有数量众多的蛋白结合点，能够有效地调节肿瘤细胞的分化和增殖[14-16]。METTL14是在哺乳动物体内发现的甲基转移酶，研究发现，胃癌组织中METTL14的表达水平明显低于对应的癌旁组织，同时还发现METTL14能够通过影响细胞周期中RNA甲基化过程，从而影响肝癌的发展[17-18]。也有部分研究者提出axin和METTL14在胃癌的发生发展过程中发挥重要的协同作用，但其作用机制尚未明确，这也成为国内外医护工作者研究的重点[19]。

研究表明，axin表达情况与食管鳞状细胞癌患者的淋巴结转移情况和浸润深度密切相关[20]。另有研究结果显示，胃癌细胞中axin基因突变率为9.7%，说明胃癌的发生可能与axin基因突变有关[5]。本研究结果显示，正常胃黏膜组织中axin蛋白的阳性表达率为75.9%，高于胃癌组织和癌前病变组织的51.9%和35.5%，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同性别、年龄和肿瘤部位的胃癌患者胃癌组织中axin蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移、中+高分化的胃癌患者胃癌组织中axin蛋白的阳性表达率均高于Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、低分化的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明axin表达水平与胃癌的发生发展关系密切，同时还与分化程度、临床分期、淋巴结转移情况有关。这也表明axin可能成为新的诊断和治疗胃癌的重要指标，可为胃癌的药物靶向治疗提供参考依据。本研究还发现，胃癌组织和癌前病变组织中axin蛋白的表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明胃癌细胞中axin基因可能已经发生了突变，导致其蛋白表达水平下降。有研究者对胃癌患者胃癌组织及其癌旁组织中METTL14的表达情况进行分析，结果显示，癌旁组织中METTL14的表达水平明显高于胃癌组织[21]。本研究发现，正常胃黏膜组织中METTL14蛋白的阳性表达率为83.5%，高于胃癌组织和癌前病变组织的35.4%和61.3%，差异均有统计学意义（P＜0.05）；且胃癌组织中METTL14蛋白的阳性表达率低于癌前病变组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明METTL14表达水平与胃癌的发生发展关系密切。同时本研究还发现，不同性别、年龄和肿瘤部位的胃癌患者胃癌组织中METTL14蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移、中+高分化的胃癌患者胃癌组织中METTL14蛋白的阳性表达率均高于临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、低分化的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。说明METTL14与胃癌的转移、侵袭有关，可为胃癌的治疗提供靶点。本研究结果显示，79例胃癌组织中，METTL14与axin共阳性表达24例，共阴性表达14例，且METTL14和axin表达呈正相关（P＜0.01）；31例癌前病变组织中，METTL14与axin共阳性表达9例，共阴性表达10例，且METTL14和axin表达呈正相关（P＜0.01）。说明两者可能存在协同作用，共同抑制胃癌细胞的分化、增殖和转移。axin和METTL14共同作用或者在其他因子的共同作用下，协同调节机体内干细胞的分化，对肿瘤细胞的分化和增殖具有抑制作用，这与国内有关研究结果一致[22]。

综上所述，胃癌组织和癌前病变组织中axin和METTL14蛋白阳性表达率均低于正常胃黏膜组织，且两者的表达呈正相关，提示两者对胃癌的发生均具有抑制作用，联合检测可作为胃癌诊断和治疗的依据。然而本研究的样本量较小，结果可能具有一定的局限性，尚需进一步研究验证。