Ki67、HER-2、VEGF和EGFR蛋白在乳腺癌组织中的表达及临床意义

刘岩岩， 童 创， 梁 惠， 王建国

(合肥市第一人民医院， 合肥 230061)

乳腺癌是乳腺外科常见疾病，也是女性患者常见的恶性肿瘤[1]。虽然近年来对乳腺癌的早期发现、早期诊断和治疗取得一定成就，但是病死率未见明显下降。有文献报道，细胞增殖核抗原(Ki67)[2]、人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)[3]、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[4]、表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)[5]在乳腺癌肿瘤细胞的分化增殖、凋亡、转移、分化中起重要作用。本研究通过免疫组织化学法检测乳腺癌患者术后肿瘤组织与癌旁组织中Ki67、HER-2、VEGF、EGFR蛋白的表达，了解其相关临床病理特征，旨在为诊断治疗提供理论支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集合肥市第一人民医院甲乳外科2013年1月-2017年12月收治的72例女性乳腺癌患者，行改良根治性手术，取手术切除乳腺病变组织为乳腺癌组，距离肿瘤边缘>5 cm的乳腺组织为癌旁正常组。年龄29～75岁，平均年龄52岁。组织学类型：浸润性导管癌61例，浸润性小叶癌2例，导管内癌3例，乳头状腺癌5例，黏液癌1例。组织学分级[6]：Ⅰ级5例，Ⅱ级28例，Ⅲ级39例。TNM分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期33例，Ⅲ期30例，Ⅳ期6例。所有患者均为初始治疗，病理诊断明确，未行术前辅助放化疗。

1.2 试剂与仪器Ki67单克隆抗体、Her-2单克隆抗体、VEGF单克隆抗体和EGFR单克隆抗体、一抗试剂盒均购自北京中杉生物技术开发有限公司。NOVA型切片机(瑞典LKB)，Nikon 80i萤光显微镜(新飞达光学仪器公司)，JEDR801D形态学图像分析系统Version6.0(捷达科技有限公司)等。

1.3 实验方法[6-7]所有标本常规脱蜡至水、透明、包埋、切片，厚4 μm；石蜡切片后常规二甲苯脱蜡，酒精梯度水化，柠檬酸盐缓冲液抗原修复，再自然冷却；3% H2O237℃ 孵育，5%正常山羊血清37℃封闭，加一抗(50 μL)，冰箱4℃过夜；次日复温，加二抗，滴加链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex，SABC)液，二氨基苯基碘(diaminobenzidine，DAB)显色5min，苏木精复染，二甲苯透明，中性树胶封片，再烤干。所有标本均在同一条件下采用免疫组织化学SABC方法进行染色，均设阴性和阳性对照。在各病理组织内随机选取10个视野(×400倍)，染色以胞浆、胞膜、胞质出现棕黄色或黄褐色沉淀物为阳性表达。

1.4 判定指标根据美国临床肿瘤学会/美国病理学家协会(American Society of Clinical Oncology/American Society of Pathologists，ASCO/CAP)病理诊断指南和2011年St.Gallen会议公式，免疫组织化学结果用DAKO Hercept Test评分系统[8-9]：(-)表示无细胞染色或<10%细胞膜较弱染色，(+)表示10%细胞膜部分较弱染色，(++)表示10%细胞膜完全较弱或中等染色，(+++)为>10%细胞膜完全强染色。按照阳性细胞占观察细胞比例半定量分级：阳性反应<10%为(-)，10%～30%为(+)，30%～50%为(++)，>50%(+++)。以(-)、(+)、(++)为阴性表达，(+++)为阳性表达。

2 结果

2.1 2组标本Ki67、HER-2、VEGF和EGFR蛋白光密度值比较乳腺癌组标本Ki67、HER-2、VEGF、EGFR蛋白光密度值分别为(0.25±0.07)、(0.61±0.19)、(0.64±0.15)、(0.58±0.21)，明显高于癌旁正常组的(0.08±0.01)、(0.19±0.18)、(0.18±0.09)、(0.16±0.05)，差异有统计学意义。此4种蛋白在乳腺癌组织中高表达，在正常组织中低表达(表1)。

2.2 免疫组织化学法检测Ki67、HER-2、VEGF和EGFR蛋白表达乳腺癌组织中Ki67、HER-2、VEGF、EGFR蛋白表达阳性率分别为84.7%(61/72)、65.3%(47/72)、45.8%(33/72)、26.4%(19/72)，在胞浆、胞膜、胞质出现棕黄色或黄褐色沉淀物，而在癌旁正常对照组表达明显减少，且染色较淡(图1)。

表1 2组标本Ki67、HER-2、VEGF和EGFR蛋白光密度值比较

图1 免疫组织化学法测Ki67、HER-2、VEGF和EGFR蛋白表达

2.3 Ki67、HER-2、VEGF和EGFR蛋白表达与临床病理特征之间关系Ki67蛋白表达与肿瘤大小、病理类型、组织学分级、有无淋巴结转移、TNM分期均显著相关(P<0.05)，与年龄无关(P>0.05)；HER-2蛋白表达与肿瘤大小、有无淋巴结转移、TNM分期明显相关(P<0.05)，与病理类型、组织学分级、年龄无相关性(P>0.05)；VEGF蛋白表达与肿瘤大小、组织学分级、有无淋巴结转移、TNM分期相关(P<0.05)，与病理类型、年龄无关(P>0.05)；EGFR蛋白表达与肿瘤大小、病理类型、组织学分级、有无淋巴结转移、TNM分期相关(P<0.05)，与年龄无关(P>0.05)(表2)。

3 讨论

随着乳腺癌发病率呈上升趋势，研究其发生发展过程中原癌基因、抑癌基因及其相关蛋白表达，了解其标记物对乳腺癌诊断、治疗、预后、降低死亡率有极其重要意义[10]，但是不同标志物与乳腺癌的临床病理关系虽有报道，相关性仍有争议。

本研究通过联合检测乳腺癌患者病理组织及癌旁正常组织中Ki67、HER-2、VEGF和EGFR蛋白的表达情况，探讨与乳腺癌发病之间的内在关联。其中Ki67是抗增殖核蛋白的单克隆抗体，是目前应用最广泛的增殖细胞标志之一，阳性表达是乳腺癌生物学行为的重要指标，与TNM分期、淋巴结转移、组织学分级、HER2均密切相关[11]。HER-2是人表皮生长因子，是一种对各种表皮细胞生长具有促进作用的基因片段，该基因过度表达可造成 HER-2 阳性，使各种表皮组织过度增殖，形成肿瘤[12]，是乳腺癌最常见的基因标志之一[13]，高表达常提示癌细胞具有较强的侵袭能力和高转移特征，表示恶性度高，虽对放化疗敏感，但缺乏相应靶向药物和内分泌治疗，易复发转移，预后较差[14-15]。VEGF来自肿瘤细胞分泌，可促进正常非增殖血管内皮细胞增生和血管网络形成，调控癌基因和抑癌基因参与乳腺癌的发生、发展，促进肿瘤增殖[16]。EGFR为酪氨酸激酶受体家族Ⅰ型成员，与乳腺癌肿瘤细胞增殖、生长关系密切，通过调控细胞增殖、分裂以及血管形成等过程，促进癌细胞侵袭转移[17]。

表2 Ki67、HER-2、VEGF和EGFR蛋白表达与临床病理关系/例(%)

研究得出Ki67、HER-2、VEGF和EGFR蛋白在肿瘤组织中较癌旁正常组织中表达明显升高(P<0.05)，差异具有统计学意义，提示上述标志物可作为乳腺良恶性肿瘤的判定指标。此外，本研究结果进一步提示Ki67蛋白表达与肿瘤大小、病理类型、组织学分级、有无淋巴结转移、TNM分期均显著相关(P<0.05)，与年龄无关(P>0.05)。HER-2蛋白表达与肿瘤大小、有无淋巴结转移、TNM分期明显相关(P<0.05)，与病理类型、组织学分级、年龄无相关性(P>0.05)，可为乳腺癌患者个体化治疗提供依据，判断化疗疗效及预后。VEGF蛋白表达与肿瘤大小、组织学分级、有无淋巴结转移、TNM分期相关(P<0.05)，与病理类型、年龄无关(P>0.05)，抑制VEGF可阻断血管内皮细胞迁移、增殖、肿瘤血管生成，诱导肿瘤细胞凋亡。EGFR蛋白在相对较大肿块、组织分化程度差、有淋巴结转移、TNM分期较晚患者中，表达明显增加(P<0.05)，与年龄因素无关(P>0.05)。相关结果在EGFR蛋白表达与TNM分期、组织学分级、有无淋巴结转移等特征相关性与卢玉元等[18]报道相一致，提示EGFR蛋白表达与乳腺癌的侵袭能力、临床分期等特征相关联，但文献报道的EGFR蛋白表达与肿瘤大小无相关性，可能与免疫组化检测过程蛋白易变性、破坏，产生一定的假阴性或假阳性有关，需要后期积累更多样本进一步分析。

总之，乳腺癌发生、发展、侵袭转移是多基因、多因素相作用的结果，联合检测Ki67、HER-2、VEGF、EGFR蛋白的表达情况，有助于对乳腺肿瘤良恶性作鉴别，对乳腺癌的诊断、治疗、预后判定具有重要临床意义。