荧光定量技术检测牛奶中四环素类药物残留准确性的研究与探讨

文/贾 涛 方 芳 郑君杰 孙志伟 卢春香

（北京市饲料监察所）

四环素类药物包含四环素、金霉素、土霉素、强力霉素，为广谱抗生素，主要用于治疗奶牛立克次氏体、衣原体、支原体等致病微生物感染病症，多为添加在饲料和饮用水中使用或注射使用。奶牛用药后，四环素类药物会残留在牛奶中，对人类健康造成危害，尤其是对婴幼儿的身体健康危害更为突出，其危害主要表现在对婴幼儿的肝脏、肾脏、牙齿与骨骼等方面的影响。因此，牛奶中四环素类药物的快速检测尤为重要，本试验利用荧光定量技术检测牛奶中四环素类药物残留，并与仪器法比较，以研究其准确性。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

四环素类荧光定量检测卡。

1.2 仪器

移液器（移液枪）、计时器、荧光免疫定量分析仪（型号：FQ-S1）。

2 检测方法

2.1 检测原理

采用竞争性免疫荧光层析法检测目标物的残留浓度，荧光标记的抗体预先包被在释放垫上。当待测样品滴加在加样区时，样品中的目标物在毛细渗移的过程中，与荧光标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体与T区包被抗原的结合，使T区荧光减弱，利用免疫荧光定量分析仪读取T线与C线位置的荧光强度，通过仪器内置的标准曲线即可计算出样品中靶标物质的含量。

2.2 样品制备

空白样品：生鲜乳（牛奶），在检测时提前恢复至室温，并充分摇匀样品（奶样不能有结块、酸味或沉淀等性状）。

添加样品：向空白样品加入四环素类标准品至所需浓度。

2.3 最低检测限的测定

取20 份空白生鲜乳样品，打开铝箔袋，取所需量的金标微孔和试纸条，做好标记，并置于桌面上（取出所需微孔和检测卡，立即密封铝箔袋，以防受潮）；吸取200 μL样本液于金标微孔中，小心吹打至孔底的紫红色颗粒完全溶解（注意吹打时动作要轻柔，避免产生气泡），室温（25±2）℃孵育3 min；取120 μL金标微孔中样品加入到加样孔中，并开始计时，准确反应10 min后，插入荧光定量分析仪读数。计算其平均值，再加上3倍标准差，即为最低检测限。

表1 空白样品添加浓度

表2 空白生鲜乳样品四环素类含量测定结果

2.4 准确度和精密度的测定

采用3 个批次四环素类荧光定量快速检测卡，对添加四环素类药物的生鲜乳样品进行测定。样品添加药物浓度为对应的最低检测限（Limit of Detection，LOD）和2倍LOD（表1），每个添加浓度做5个平行，计算样品添加回收率和批内、批间的变异系数。

2.5 与仪器方法进行比较

采用四环素类荧光定量检测卡和仪器法，分别对50 份生鲜乳盲样进行测定，比较测定结果。仪器方法按照GB/T 22990—2008《牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法》中所述的检测方法进行操作。

3 试验结果

3.1 最低检测限的测定

取20 份空白生鲜乳样品，按照四环素类荧光定量检测卡的操作说明书方法进行检测，计算其平均值，再加上3 倍标准差，即为最低检测限（表2）。

结果表明，以四环素为对照物建立标准曲线，得出该药物的最低检出限为4.93 μg/L，为保障产品的稳定性，可认为四环素类荧光定量检测卡在生鲜乳中的检测限为5.00 μg/L。

3.2 准确度和精密度

准确度是指测定值与真实值的符合程度，按2.4中的步骤操作，结果见表3。结果表明，所有样品各添加浓度的回收率均在84.60%～113.94%。各添加浓度的批内、批间变异系数均低于15.00%。

3.3 与仪器方法比较

采用该四环素类荧光定量检测卡和仪器法，分别对50 份生鲜乳盲样进行测定，比较测定结果，以检测限作为阴、阳性判定值，小于四环素类荧光定量检测卡检测限的检测结果记为“-”，仪器结果记为“ND”，大于四环素类荧光定量检测卡检测限，以实际检测值表示（表4）。结果显示，二者的符合率为100%。

4 分析与讨论

为评价本试验研制的四环素类免疫荧光定量检测卡的可靠性，采用空白样本进行回收率试验，分别从检出限、准确度、精密度和与仪器方法比较等4 个方面进行验证。

4.1 最低检测限

取20 份空白样本进行检测，检测信号值，并通过标准曲线得出待测物浓度，计算各对应浓度值的标准差，由平均值加3 倍标准差即为该样本的最低检测限。经试验发现，四环素类荧光定量检测卡在生鲜乳中的检测限为5.00 μg/L。

4.2 精密度与准确度

选取空白样本，添加各药物检测限浓度标准品并检测，每个浓度重复验证10 次，并统计添加回收率和相对标准偏差。用3 个批次荧光定量检测系统，对空白添加样品进行测定，每种样品的添加浓度为LOD和2LOD，每个添加浓度做5 个平行，计算样品的添加回收率和批内、批间变异系数。经试验，所有样品各添加浓度的回收率均在84.60%～113.94%，各添加浓度的批内、批间变异系数均低于15.00%。

表3 准确度和精密度

表4 与仪器方法比较结果 单位：μg/L

4.3 与仪器方法进行比较

本试验研制的荧光定量检测卡和仪器法分别对50 份生鲜乳盲样进行测定，比较测定结果。仪器方法根据国家标准规定进行操作，结果显示，通过对盲样的测定，四环素类荧光定量检测卡和仪器法的阳性符合率为100.00%。