花椒提取物对肝癌细胞HepG2细胞增殖和凋亡及Nrf2/ARE信号通路的影响

米凯 黄锐（通讯作者）

（1核工业四一六医院<成都医学院第二附属医院>普外科 四川 成都 610501）

（2四川省医学科学院<四川省人民医院> 四川 成都 610072）

肝细胞癌（hePatocellular carcinoma，HCC）病情隐匿，早期极难发现，95%的患者在确诊时已为晚期[1]。由于肝癌细胞对放化疗药物具有一定抗性，目前除了早期手术切除外，尚无有效治疗方法[2]。肝癌产生的本质归结于细胞程序性死亡被阻断导致的细胞无限增殖，因此诱导癌变细胞重新进入凋亡和生长抑制途径将给肝癌治愈带来根本性改变[3]。研究表明，花椒提取物具有止痛、抗氧化、抗炎、还原剂等作用的同时还具有抗肿瘤作用[4]。但有关花椒提取物对肝癌细胞的作用报道少见，因此，本实验研究花椒提取物对人肝癌HePG2细胞增殖、凋亡及Nrf2/ARE信号通路的影响，为探索肝癌的高效靶向治疗联合用药提供新思路。

1.资料与方法

1.1 花椒提取物制备

花椒（原产地四川）仔细剔除花椒种子等杂质，称取200g，经无菌蒸馏水冲洗后经75%酒精冲洗一次，投入4000mL 75%酒精室温浸泡24h后过滤，弃滤渣，得浸出液，将浸出液减压蒸馏后获得浓缩原液，使用真空冷冻干燥机对原液进行冷冻干燥，得粉末，置入干燥器备用。精密天平准确称量200mg干燥粉末用1mL二甲基亚砜（DMSO）溶解，0.22μm一次性滤器过滤除去不溶解杂质，得ZMBE，放入4℃冰箱保存，使用前用DMEM培养基稀释ZMBE药物到所需浓度[5]。

1.2 细胞培养

HePG2肝癌细胞（南京凯基生物）在含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素和链霉素）的DMEM高糖培养基中，置于温度37℃、含5%CO2培养箱培养，取对数生长期细胞，分成对照组和ZBME组。对照组加入DMSO，花椒提取物组加入溶解于DMSO的ZBME：8μg/mL，37℃孵育48h后，收集所有细胞。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖能力

取收集的细胞，按照CCK-8检测试剂盒（北京索莱宝生物）说明检测，将各组细胞按每孔3×103个细胞接种于96孔板，加入100μL完全培养液于37℃、含5%CO2培养箱，培养48h后，每孔加入10μL CCK-8，继续培养4h后用酶标仪检测各组细胞在450nm处的吸光度值（A），细胞增殖活力（%）=（A实验组-A对照组）/A对照组×100%。

1.4 流式细胞技术检测细胞凋亡

取收集的细胞，按Annexin V-PI说明书（北京索莱宝生物）检测，各实验组细胞以5×105/mL的密度接种于6孔板中，培养48h后取出6孔板，用PBS清洗细胞表面残留的培养液，常规重悬后加入AnnexinV APC、7-AAD，轻轻摇动，使其混合均匀，室温避光孵育15min，上流式细胞仪（美国BD）检测，总凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.5 实时荧光定量PCR检测

采用RNA提取试剂盒（Invitrogen）提取细胞总RNA，测定A260和A280吸光度值，电泳确定RNA的完整性后，依据mRNA反转录试剂盒说明，合成cDNA，用PCR仪扩增，实验结果在荧光定量操作系统中进行分析对比，采用2-ΔΔCt对血红素加氧合酶-1（HO-1）、醌氧化还原酶-1（NQO1）、ARE mRNA表达进行相对定量。

1.6 统计学方法

数据采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（）表示，进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 花椒提取物对细胞增殖、凋亡的影响

细胞增殖、凋亡实验结果显示，花椒提取物组的细胞增殖显著低于对照组（P＜0.01）；细胞凋亡花椒提取物组显著高于对照组（P＜0.01）；见表1，图1。

表1 不同处理组细胞增殖、凋亡比较（）

表1 不同处理组细胞增殖、凋亡比较（）

组别 n 细胞增殖 细胞凋亡花椒提取物组 3 0.77±0.02** 14.94±1.58**对照组 3 1.01±0.05 5.63±0.92 t 10.090 8.802 P＜0.001 0.001

图1 细胞凋亡

2.2 花椒提取物对Nrf2/ARE信号通路因子的影响

qRT-PCR结果显示，花椒提取物组的HO-1、NQO1、ARE mRNA表达显著高于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 不同处理组HO-1、NQO1、ARE mRNA表达

3.讨论

肝细胞癌（HCC）的发生发展是由多步骤、多因素、多基因共同参与而导致的结果，其与肺癌、胰腺癌一起被称为病死率最高的三大癌症[6]。目前临床治疗晚期肝癌靶向药物价格昂贵，给我国众多肝癌患者治疗带来极大不便。因此，本研发具有良好抗肝癌效果且适合我国国情的药物，为肝癌治疗提供依据。

花椒具有较高的食用和药用价值，其具有较强的抗氧化性、消除自由基、抗肿瘤效果[5]。目前已证实花椒提取物可以诱导多种恶性肿瘤细胞凋亡[7]。本实验结果显示花椒提取物具有直接抑制肝癌HePG2细胞的作用，CCK-8检测发现花椒提取物组的细胞增殖显著低于对照组（P＜0.01）；流式细胞术Annexin V/PI双染色观察到细胞凋亡花椒提取物组显著高于对照组（P＜0.01）。提示花椒提取物抑制肝癌HePG2细胞的增殖并促进肝癌HePG2细胞的凋亡是其抑制肝癌细胞增殖、生长的主要途径之一。

Nrf2/ARE信号通路能够启动下游多种保护性基因的表达，已证实Nrf2/ARE信号路径调节的可编码内源性保护基因超过200个[8]。ARE是一个特异的DNA-启动子结合序列，其可保护细胞组织正常功能。HO-1可与其酶降解产物共同发挥抗炎、抑制细胞凋亡等作用，是机体最重要的内源性保护体系之一。NQO1是一种调节细胞物质处于氧化还原状态的黄素酶，对各种代谢引起的氧化应激反应具有保护作用。本试验结果显示，花椒提取物组的HO-1、NQO1、ARE mRNA表达显著高于对照组（P＜0.05），提示花椒提取物可激活Nrf2/ARE信号通路。

综上所述，花椒提取物可抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡，并激活Nrf2/ARE信号通路，达到抗癌作用。但由于花椒提取物成分复杂，含量不一，其具体的抗肿瘤作用机制有待进一步深入研究。