高迁移率族蛋白2在结直肠癌组织中的表达及临床意义

李前，李定明，王卫卫，邱家声，陈泽群

（广东省茂名市人民医院 胃肠外科，广东 茂名 525000）

结直肠癌是全球范围内第三大常见的恶性肿瘤，也是全球癌症相关死亡的第二大原因[1]，由于生活和饮食习惯的改变，过去10年来，我国结直肠癌发病率迅速上升[2-3]。复发和转移是导致结直肠癌患者预后不佳的主要原因[4]，转移性结直肠癌患者5年生存率约为13.9%[5-6]。高迁移率族蛋白（high-mobility group box，HMGB）是高迁移率族蛋白超家族（HMG）成员之一，含有HMG盒基序，其家族的4个成员分别为HMGB1～4，其中HMGB1和HMGB2都是高度保守的核蛋白，作为染色质结合因子，可结合DNA并促进转录蛋白组装[7]。研究[8-9]证实HMGB1是结直肠癌的致癌基因，其高表达是预测结直肠癌预后的分子标志物。HMGB2在胚胎发育过程中高表达，主要在成人睾丸和淋巴器官中表达[10]，在前列腺和卵巢癌中发现HMGB2可调控细胞增殖、迁移和凋亡[11]。在胃癌中，HMGB2高表达与胃癌预后不良相关[12]。然而，结直肠癌中HMGB2表达模式和临床意义尚未见报道。本研究通过免疫组化方法评估结直肠癌患者组织标本中HMGB2表达模式及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源

回顾性分析我院2012年1月—2014年1月间胃肠外科收治并行结直肠癌切除术患者共82例。纳入标准：⑴ 经手术后切除病理诊断为原发性结直肠癌患者；⑵ 除结直肠癌外，不存在其他原发肿瘤；⑶ 患者检验及病例资料完整且有完整随访资料者；⑷ 结直肠癌患者按NCCN指南原则治疗。排除标准：⑴ 不符合上述标准者；⑵ 患者随访资料缺失者。本研究经医院伦理委员会批准实施。

1.2 临床资料收集

从患者病历资料中提取临床和病理资料。其中临床参数包括如下：年龄、性别、肿瘤部位、淋巴结转移和远处转移。根据国际癌症控制联盟（UICC）和美国癌症联合委员会（AJCC）结直肠癌TNM分期系统推荐的肿瘤-淋巴结-转移（TNM）分类系统（第8版）[13]对病理切片进行评估。由2名对患者的临床资料不知情的病理医师对肿瘤样本进行独立评估。

1.3 随访

无瘤生存时间定义为患者术后当天至随访期间肿瘤首次复发时间或随访截止时间之间的时间间隔。总生存时间定义为患者手术后当天到随访期间或死亡或随访截止时间之间的时间间隔。术后通过门诊或电话定期随访，每半年随访1次，随访内容包括复发及生存情况。

1.4 免疫组化

通过孵育5 μm厚的石蜡包埋的结直肠癌切片行免疫组织化学染色。将石蜡包埋的切片在二甲苯中脱石蜡并在不同浓度梯度的系列乙醇中再水合；用3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶活性，并用3%山羊血清阻断非特异性抗原。随后，将抗HMGB2（1:200；英国Abcam公司）一抗4 ℃下孵育于组织切片过夜。以磷酸盐缓冲盐水孵育的切片为阴性对照。将切片与过氧化物酶缀合的二抗于37 ℃室温孵育2 h。待组化切片出现棕黄即终止染色，组织切片用苏木精复染，显微镜下观察。

1.5 免疫组化评分

选择每个载玻片中至少5个随机视野并由2名病理医师独立评估。阳性细胞的百分比评分：0分=0%细胞染色；1分=1%～10%细胞染色；2分=11%～50%细胞染色；3分=51%～100%细胞染色。染色强度评分如下：0分=阴性染色；1分=弱染色；2分=中度染色；3分=重度染色。最终免疫评分=染色百分比评分×染色强度评分。染色评分0～4分定义为低表达,染色评分6～9分定义为高表达。

1.6 统计学处理

所有分析均使用SPSS 17.0软件进行。χ2检验评估临床病理因素与HMGB2表达之间的关系，Kaplan-Meier生存分析及对数秩检验分析和比较患者生存率，Cox比例风险回归模型分析影响结直肠癌患者预后的因素，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 结直肠癌组织中HMGB2的表达

免疫组化显示HMGB2主要表达于癌细胞细胞核中。全部患者中HMGB2高表达者比例为60.9%（50/82），HMGB2低表达者比例为39.1%（32/82）。HMGB2在结直肠癌癌组织中代表性免疫组化染色结果见图1。

2.2 结直肠癌组织中HMGB2表达与临床病理因素的关系

HMGB2高表达与患者的组织学分化程度低、临床分期、T分期、N分期和M分期有关（均P＜0.05）；与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置无关（均P＞0.05）（表1）。

2.3 结直肠癌组织中HMGB2表达与患者预后间的关系

生存分析示，HMGB2高表达组5年无瘤生存率和总生存率分别为27.7%和32.1%，而HMGB2低表达组5年无瘤生存率和总生存率分别为38.7%和41.5%，HMGB2高表达组无瘤生存率和总生存率均明显低于HMGB2低表达组（均P＜0.05）（图2）。

图1 免疫组织检测HMGB2表达（标尺：100 μm） A：癌组织中HMGB2低表达；B：癌组织中HMGB2高表达Figure 1 Immunohistochemical staining for HMGB2 expression (bar:100 μm) A: Low expression of HMGB2 in cancer tissue; B: High expression of HMGB2 in cancer tissues

表1 结直肠癌患者中HMGB2表达与临床病理因素之间的关系[n（%）]Table 1 Associations between HMGB2 expression and clinicopathologic characteristics in colorectal cancer patients [n (%)]

图2 不同HMGB2表达状态结直肠癌患者生存曲线Figure 2 Th e survival curves between colorectal cancer patients with diff erent HMGB2 expressions

2.4 结直肠癌患者无瘤生存率的影响因素分析

单因素分析示：患者临床分期、T分期、N分期、M分期和HMGB2表达是影响结直肠癌患者无瘤生存率的危险因素（均P＜0.05），多因素分析示：M分期（P=0.002）和HMGB2表达（P=0.027）是影响结直肠癌患者无瘤生存率的独立危险因素（表2）。

2.5 结直肠癌患者总生存率的影响因素分析

单因素分析示：患者临床分期、T分期、N分期、M分期、组织分化和HMGB2表达是影响结直肠癌患者总生存率的危险因素（均P＜0.05），多因素分析示：M分期（P=0.001）和HMGB2表达（P=0.005）是影响结直肠癌患者总生存率的独立危险因素（表3）。

表2 结直肠癌患者术后无瘤生存率影响因素的单变量与多变量分析Table 2 Univariate and multivariate analyses of factors for disease-free survival in colorectal cancer patients

表3 结直肠癌患者术后总生存率影响因素影的单变量与多变量分析Table 3 Univariate and multivariate analyses of factors for overall survival in colorectal cancer patients

3 讨 论

随着结肠镜筛查的普及，越来越多的结直肠癌患者在疾病早期被诊断，但仍存在部分患者确诊时已处于中晚期，导致术后效果欠佳[14-18]。

HMGB2蛋白是H M G蛋白家族之一，位于4q34.1上，分子量约15 kD，尽管其与癌基因HMGB1高度同源且80%蛋白质相似，但其在癌症中的表达模式和功能研究少见报道[19-22]。

最近研究[12]报道在198例胃癌癌组织中，HMGB2高表达占110例，低表达占88例，这与本研究结果类似。本研究发现HMGB2高表达与结直肠癌患者组织学分化程度低、临床分期晚、T分期、N分期和M分期密切相关（均P＜0.05），提示HMGB2高表达患者肿瘤分化程度低且处于临床晚期。HMGB2高表达与结直肠癌患者年龄、性别、肿瘤大小和肿瘤位置间无明显关系。文献[12]报道HMGB2高表达与胃癌患者晚期临床分期相关，结果与本研究类似。

本研究发现HMGB2高表达组患者无瘤生存率和总生存率均显著低于HMGB2低表达组患者，提示HMGB2高低表达组患者无瘤生存率和总生存率存在差异。单因素和多因素分析均显示HMGB2表达是影响结直肠癌患者无瘤生存率和总生存率的独立危险因素。Kwon等[23]报道肝细胞癌患者癌组织中HMGB2高表达与患者总生存率低显著相关，且敲降HMGB2表达可在体外抑制肝癌细胞的增殖和侵袭能力。Wu等[24]证实HMGB2蛋白在多形性胶质母细胞瘤中的表达显著高于正常脑组织，HMGB2高表达是影响多形性胶质母细胞瘤患者总生存率的唯一独立危险因素，体外沉默HMGB2表达可显著降低癌细胞活力、侵袭能力并显著抑制小鼠体内成瘤能力。上述研究结果均提示HMGB2高表达促进肿瘤进展，且和肿瘤预后不良密切相关。

在结直肠癌中HMGB2表达影响预后的机制尚不清楚，可能机制如下：⑴ HMGB2基因表达可能参与癌细胞的凋亡：文献[25]报道在结直肠癌细胞系中，HMGB2表达水平高于正常结直肠癌细胞系，结直肠癌细胞系HMGB2高表达通过调节P53基因表达抑制癌细胞凋亡。⑵ 在结直肠癌中，HMGB2基因受到长链非编码RNA表达调节，研究显示长链非编码RNA CRCMSL可显著降低癌细胞系中HMGB2基因表达水平，进而抑制癌细胞增殖和侵袭能力，并促进凋亡[26]。⑶ HMGB2表达影响癌细胞糖代谢过程，研究发现在乳腺癌细胞中[21]，HMGB2通过靶向乳酸脱氢酶B和果糖-1，6-二磷酸酶1促进乳腺癌细胞的代谢重编程过程而加速癌症进展。本研究中发现的HMGB2高表达与患者不良预后相关是否与上述因素相关需要进一步研究。

本研究存在如下局限性：本研究为单中心回顾性研究，病例数目较少，尚需要多中心大样本研究来证实本研究结论；未探讨HMGB2影响结直肠癌患者预后的分子机制。

总之，结直肠癌中HMGB2表达与患者恶性临床病理特征密切相关；HMGB2表达是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素。