多梳蛋白4与含FERM结构域蛋白4A在胃癌组织中的表达及与意义

钱海权，周海宁，刘轲，赵伟

（宁夏医科大学总医院 胃肠外科，宁夏 银川 750004）

胃癌是一种起源于胃黏膜上皮的全球性常见恶性肿瘤，我国是胃癌高发国家，2015年新发病例约67.9万，死亡病例约49.8万[1]，发病率和病死率均占全球胃癌发病率和病死率的50%[2]。随着生活水平的提高和饮食结构的改善，我国胃癌发病率和病死率呈下降趋势，但仍处于世界较高水平，依然严重威胁人类健康[3]。随着科技和医疗水平的发展，对胃癌研究取得很大进展，但其早期筛查不易，一经发现80%以上均已进入中晚期。另外，胃癌患者术后5年生存率较低，仅为30%左右[4-6]。胃癌发生发展过程极其复杂，与患者生活饮食习惯、工作压力增大、遗传因素及幽门螺旋杆菌感染等因素密切相关，此外，抑癌基因突变、失活、原癌基因激活等均可使细胞恶性增殖，参与肿瘤发生发展过程[7-11]。因此研究与胃癌发生发展相关的分子标志物具有重要意义。chromobox（CBX）家族属于多梳基因家族蛋白（polycomb group protein，PcG）家族中特殊的一类，CBX包括5个亚型，多梳蛋白4（chromobox homolog 4，Cbx4）是一种泛素化（SUMO）E3连接酶，可抑制上皮干细胞的激活和分化，促进肿瘤血管生成[12-14]。含FERM结构域蛋白4A（FERM domain-containing protein 4A，FRMD4A）可促进癌细胞生长，其高表达与头颈部鳞癌复发转移风险高度相关[15-16]。但Cbx4和FRMD4A蛋白在胃癌中的研究尚鲜有报道，因此本研究拟观察Cbx4和FRMD4A蛋白在胃癌组织中表达，研究其与胃癌临床病理参数和预后的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2010年2月—2013年11月在本院初诊胃癌患者112例作为研究对象，其中男60例，女52例；年龄35～70岁，平均年龄（51.25±11.65）岁，收集患者临床资料及手术过程中胃癌组织和癌旁组织标本。本研究经过院道德伦理委员会批准通过，所有样品采集均取得患者及家属知情同意并签字，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 纳入排除标准

纳入标准：⑴ 经手术病理确诊为胃癌患者；⑵ 自愿参加治疗调查者；⑶ 术前未接受放化疗；⑷ 有完整随访资料者。排除标准：⑴ 患有其他恶性肿瘤者；⑵ 患有严重肝肾等重要脏器疾病者；⑶ 患有自身免疫性疾病者；⑷ 生活不能自理或精神状态异常者；⑸随访资料不完整者。

1.3 研究方法

1.3.1 主要试剂及仪器TRIzol试剂（编号：R0016）购自上海碧云天； PrimeScript™RT reagent Kit（Perfect Real Time）（编号：RR037A）、PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（编号：6210A）购自北京TaKaRa； 鼠 源 anti-Cbx4（ 货 号：MA5-31666）适用稀释浓度1:500，兔源anti-FRMD4A（货号：PA5-58394）适用稀释浓度1:100，均购自美国Invitrogen；紫外分光光度计（美国Thermo公司）、qRT-PCR仪7500（美国Bio-Rad公司）等。

1.3.2 标本采集收集112例胃癌患者手术中胃癌组织标本，及距离癌旁组织＞5 cm处癌旁组织标本，一部分于液氮中保存备用，另一部分制备石蜡标本。

1.3.3 临床病例特征分期标准胃癌采用2018年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会（International Union Against Cancer/ American Joint Committee on Cancer，UICC/AJCC）第8版TNM分期标准[17]：T（原发灶），T1+T2（孤立肿瘤无血管受侵+孤立肿瘤有血管受侵或多发肿瘤直径≤5 cm）21例，T3+T4（多发肿瘤直径＞5 cm+侵及周围组织）91例；N（区淋巴结），N0（无淋巴转移）39例，N1（区域淋巴转移）73例；M（远处转移），无远处转移69例，有远处转移43例；分化程度，低分化41例，中分化31例，高分化40例。

1.3.4 qRT-PCR检测Cbx4和FRMD4AmRNA表达 采用TRIzol提取胃癌及癌旁组织总RNA，紫外分光光度计检检测总 RNA 浓度及纯度。反转录得到cDNA，置于-20 ℃保存备用。采用qRTPCR检测胃癌及癌旁组织中Cbx4和FRMD4A mRNA相对表达量。qRT-PCR反应采用20 µL体系：TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）10 µL，ROX Reference Dye or Dye II（50×）0.4 µL ，cDNA（50 ng/µL）2 µL， 上 下 游 引 物（10 µmol/L）各 0.8 µL，ddH2O 6.0 µL。反应采用两步法，条件设置为：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40个循环；添加溶解曲线。Cbx4、FRMD4A及内参β-actin的引物（由上海生工合成）序列见表1。采用2-ΔΔCT法对胃癌及癌旁组织中Cbx4和FRMD4A mRNA相对表达水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.3.5 免疫组化法检测Cbx4和FRMD4A蛋白表达石蜡组织切块以4 µm厚度连续切片，之后置于60 ℃烤箱1 h，取出后置于预热二甲苯溶液中浸泡10 min，重复3次；梯度乙醇浸泡脱水，3%双氧水室温避光灭活内源性过氧化物酶15 min，枸橼酸钠抗原高压修复5 min，添加Cbx4（1:500）和FRMD4A（1:100）蛋白多克隆抗体，4℃孵育过夜，依次添加生物素标记二抗和DAB显色液，苏木素复染，盐酸酒精短暂分化后，脱水、透明、封片。用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3.6 阳性结果判定由2名资深病理医师双盲法分别对染色结果进行半定量评分。细胞浆或核内呈黄色或棕色颗粒为阳性染色，采用免疫反应积分（IRS）法进行评分：染色强度（SI）积分，无着色（0分），淡黄色（1分），棕黄色（2分），棕褐色（3分）；阳性染色细胞百分比（PP）积分，阴性（0分），PP 1%～10%（1分），PP 11%～50%（2分），PP 51%～75%（3分），PP 76%～100%（4分）。IRS= SI×PP，IRS＞3为阳性。

1.4 随访

对所有治疗出院后的胃癌患者进行电话或门诊随访，随访时间为1～60个月，末次随访时间截止2018年12月30日，死亡患者以死亡时间作为随访截止日期，观察记录患者随访期间胃癌生存死亡情况。

1.5 统计学处理

利用SPSS 22.0进行统计学分析，计数资料以[n（%）]表示，进行χ2检验，计量资料以均数标准差（x±s）表示，进行t检验，多组资料进行单因素方差分析；采用Cox多因素回归分析影响胃癌患者预后的因素。P＜0.05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胃癌及癌旁组织中Cbx4和FRMD4A mRNA表达水平比较

与癌旁正常组织比较，胃癌组织中Cbx4和FRMD4A mRNA表达水平均明显升高（P＜0.05）（表2）。

2.2 胃癌及癌旁组织中Cbx4和FRMD4A蛋白表达水平比较

Cbx4和FRMD4A阳性表达主要位于细胞核，呈棕黄色颗粒状（图1）。Cbx4在胃癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织（χ2=21.987，P=0.012），FRMD4A在胃癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（χ2=23.459，P=0.005）（表3）。

表2 胃癌及癌旁组织中Cbx4和FRMD4A mRNA表达水平比较（n=112，±s）Table 2 Comparison of the mRNA levels of Cbx4 and FRMD4A in gastric carcinoma and adjacent tissue (n=112,±s)

表2 胃癌及癌旁组织中Cbx4和FRMD4A mRNA表达水平比较（n=112，±s）Table 2 Comparison of the mRNA levels of Cbx4 and FRMD4A in gastric carcinoma and adjacent tissue (n=112,±s)

组别 Cbx4 FRMD4A胃癌组织 2.38±0.25 3.27±0.64癌旁组织 1.14±0.32 1.29±0.35 t 47.332 28.726 P ＜0.001 ＜0.001

图1 免疫组化检测Cbx4和FRMD4A蛋白表达（×400）Figure 1 Immunohistochemical staining for protein expressions of Cbx4 and FRMD4A（×400）

表3 胃癌及癌旁组织中Cbx4和FRMD4A蛋白阳性表达率比较[n=112，n（%）]Table 3 Comparison of the positive expression rates of Cbx4和 FRMD4A proteins in gastric cancer and surrounding tissue [n=112, n (%)]

2.3 Cbx4和FRMD4A蛋白表达水平与胃癌临床病理参数的关系

112例胃癌组织中，Cbx4阳性表达组78例，阴性表达组34例；FRMD4A阳性表达组81例， 阴性表达组31例。分析结果显示，Cbx4及FRMD4A表达水平与胃癌患者年龄、性别无关（P＞0.05），与T分期（χ2=14.073、13.094，P均=0.000）、N分期（χ2=1 3.9 5 7、2 2.5 2 3，P=0.0 0 1、0.000）、分化程度（χ2=14.176、20.632，均P=0.000）及远处转移（χ2=5.503、10.331，P=0.019、0.001）有关（P＜0.05）（表4）。

表4 Cbx4和FRMD4A蛋白表达水平与胃癌患者临床病理参数的关系[n=112，n（%）]Table 4 Relations of Cbx4 and FRMD4A expressions with clinicopathologic features of gastric cancer patients [n=112, n (%)]

2.4 胃癌组织中Cbx4和FRMD4A蛋白表达水平与胃癌患者5年生存率的关系

112例胃癌患者5年内死亡72例，存活40例，5年总生存率为3 5.7 1%。生存分析结果显示，C b x 4蛋白阳性表达胃癌患者5年生存率（13.89%）明显低于阴性表达患者（46.05%）（χ2=15.42，P=0.000）；FRMD4A蛋白阳性表达胃癌患者5年生存率（11.77%）明显低于阴性表达患者（46.15%）（χ2=21.55，P=0.000）（图2）。

图2 Cbx4和FRMD4A蛋白表达与胃癌患者5年生存率的关系Figure 2 Relations of the Cbx4 and FRMD4A protein expressions withthe 5-year survival rates of the gastric cancer patients

2.5 Cox回归分析影响胃癌患者预后的危险因素

单因素分析显示，胃癌患者T分期、分化程度、远处转移、胃癌组织中Cbx4和FRMD4A蛋白表达水平是影响胃癌患者预后的危险因素。Cox多因素分析显示，T分期、远处转移、Cbx4和FRMD4A蛋白表达水平是影响胃癌患者预后的独立危险因素（均P ＜0.05）（表5）。

表5 胃癌患者预后因素的Cox回归分析Table 5 Cox regression analysis of prognostic factors for gastric cancer patients

3 讨 论

P c G蛋白在胚胎早期和肿瘤形成过程中出现，主要存以多梳蛋白复合体（polycomb group complex，PRC）蛋白形式存在，主要包括Cbx2、Cbx4、Cbx6、Cbx7、Cbx8等成员，该类蛋白是一种在染色质水平上通过表观遗传修饰抑制靶基因转录的调节因子，在DNA修复、细胞分化、衰老中起重要作用，与细胞增殖、分化、肿瘤形成密切相关[18-21]。Ni等[22]研究报道，Cbx7与p-Akt、胃癌组织干细胞标志物OCT-4、CD133呈正相关，可通过下调p16、激活Akt-NF-кB-miR-21信号通路维持胃癌干细胞样特性。Cbx4是PcG蛋白家族中一种特殊蛋白，它是一种SUMO E3连接酶，Mei等[23]研究报道，Cbx4可通过对低氧诱导因子1α（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）第391位及477位赖氨酸残基SUMO化修饰上调其活性，进而调控血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达促进肝细胞癌血管再生。Zheng等[24]研究报道，Cbx4表达水平升高可促进肝癌肿瘤生长，过表达miR-195可靶向下调肝癌HepG2细胞中Cbx4表达水平，抑制肝癌HepG2细胞增殖、侵袭及迁移。本研究结果发现，胃癌组织中Cbx4 mRNA及蛋白阳性表达率均高于癌旁组织，且Cbx4阳性表达与胃癌T、N分期、分化程度及远处转移有关，与Cbx4在其他肿瘤中报道一致[24-25]，提示Cbx4阳性表达可能与胃癌发生发展及严重程度有关，但是否与其他癌症中类似机制，有待进一步探究。

FRMD4A是一类具有FERM结构域蛋白，可连接细胞质膜与细胞骨架、协助维持细胞形态和细胞膜稳定，可促进癌细胞生长，在头颈癌等癌症的发生发展中起重要作用[26-28]。郑相淮等[29]研究报道，FRMD4A高表达与舌鳞状细胞癌的发展及转移密切相关，下调FRMD4A蛋白表达，可将舌癌CAL-27细胞阻滞在G1期，抑制其增殖。Zheng等[15]研究显示，FRMD4A蛋白表达与舌癌发生有关，沉默FRMD4A基因可以降低CAL27细胞增殖，导致细胞周期停滞在G1期，并显著抑制CAL27细胞的迁移和侵袭能力。本研究结果发现，与正常癌旁组织比较，胃癌组织中FRMD4A mRNA及蛋白表达水平均明显升高，且与胃癌T、N分期、分化程度及远处转移有关，提示FRMD4A蛋白表达可能对胃癌发生发展及远处转移产生影响，有潜力成为胃癌病情监测敏感指标。

本研究结果还发现，Cbx4和FRMD4A蛋白阳性表达组胃癌患者5年生存率均明显低于阴性表达组患者，且T分期、有远处转移、Cbx4和FRMD4A蛋白表达水平是影响胃癌患者预后的独立危险因素，提示检测Cbx4和FRMD4A蛋白表达水平可能对胃癌患者预后评估有一定指导意义。

综上所述，Cbx4和FRMD4A蛋白在胃癌组织中高表达，与胃癌临床分期、分化程度及5年生存率有关，可能与胃癌的发生发展及预后有关，可能对胃癌临床靶向治疗及预后评估提供一定理论基础。但由于本研究样本量较少，结果具有局限性，另关于Cbx4和FRMD4A对胃癌细胞生物活性的影响及具体作用机制及有待进一步探索。