TNIP1/ANXA6 基因多态性与中国维吾尔族寻常型银屑病临床表型及病情相关性研究

丁 媛 冯燕艳 向 芳 刘建勇 康晓静

银屑病是一种复杂的、炎性的、免疫学介导的、多因素的和过度增殖的皮肤病，遗传和环境因素在其病因学中发挥着重要意义，约1%～3%的世界人口都患有银屑病，不同种族后裔的患病率差异很大，表明银屑病易感性存在种族间差异。国内外不同研究者应用遗传连锁分析原理，通过全基因组扫描研究共发现了至少12个不同的(PSORS)银屑病易感基因位点，然而，大多数PSORS基因座的基因易感性仍不清楚[1]。近年来研究显示许多NF-κB通路下调的基因具有银屑病易感性，包括TNIP1和ANXA6(TNFAIP3相互作用蛋白1和膜联蛋白A6)[2]。为研究TNIP1/ANXA6基因与新疆维吾尔族寻常型银屑病人群相关性，笔者选择位于TNIP1/ANXA6基因区域的rsl7728338、rs999556 2个位点单核苷酸基因多态性(single nucleotidepolymorphisms，SNP)进行分析，采用连接酶检测反应(ligasedetection reaction，LDR)对上述基因进行基因分型，探讨其与维吾尔族人群寻常型银屑病临床表型尤其是疾病严重程度的相关性。

对象与方法

1.研究对象：选取新疆自治区人民医院皮肤性病科332例维吾尔族寻常型银屑病患者，诊断符合寻常型银屑病的诊断标准。 银屑病病情轻重参照银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI)标准计分，根据不同部位的皮损面积和红斑、鳞屑、浸润的严重程度，计算综合积分。PASI≥10分为重型，<10分为轻型。 330例年龄与性别匹配的健康人来自新疆维吾尔自治区人民医院体检中心的维吾尔族健康人群或者来自皮肤科门诊无自身免疫性和系统性疾病的维吾尔族非银屑病患者，同时排除其一、二、三级亲属患有银屑病。采集外周静脉血 5ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，置于-80℃冰箱保存备用。本研究已通过新疆维吾尔自治区人民医院伦理学委员会批准，并在实施过程中遵守赫尔辛基宣言，所有病例及对照均签署知情同意书。

2.SNP选择：根据既往文献选择2个SNP(rsl7728338和rs999556)进行分型实验。

3.研究方法：(1)基因组 DNA 提取：利用基因组 DNA 提取试剂盒(Qiagen)DNA 抽提试剂盒(250) 提取患者及对照基因组DNA，用分光光度仪分别于260nm和280nm波长处检测吸光度，计算DNA浓度，并用凝胶电泳检测DNA质量，所有DNA样本均合格。 (2)引物及探针的合成：用在线软件Primer3input 设计特异性引物，rsl7728338上游引物:5′-AAAATGTGGTTTGTTCAGC-3′,下游引物:5′-TAGGAAGGCAGGGTGCATT-3′。rs999556上游引物:5′-TTTCGCCCCTGTCATCTGGT-3′,下游引物:5′-TGCCCAAGGTCAAAGGATGA-3′。根据Oligo软件设计LDR探针，根据LDR探针设计原则设计LDR的上下游探针[3]。(3)多重PCR和LDR反应体系：PCR反应体系(20μl)为：1μl模板，2μl缓冲液，0.6μl Mg2+,2μl dNTP,0.2μl TaqDNA聚合酶，2μl引物混合液，PCR专用水补齐12.2μl。PCR反应条件：95℃预变性2m→94℃变性30s→56℃退火1.5min→65℃延伸30s(进行35个循环)→65℃延伸10m→产物于-20℃保存备用。LDR反应体系(10μl)为：内含4μl PCR产物，1μl×缓冲液, 1μl探针混合液，0.05μl Taq DNA连接酶，，PCR专用水补齐4μl。LDR反应循环条件：95℃变性2min→94℃15s→50℃ 25s(40个循环)→产物于-20℃保存备用。(4)测序与基因分型：扩增产物送至上海生工公司测序,测序仪器为美国 ABI3730型DNA全自动测序仪完成测序并记录结果。 最后用Genemapper软件进行数据分析，判读各位点上各样本的基因分型。

结 果

1.基线资料:病例组244例男性和88例女性银屑病患者，对照组248例男性和82例女性健康志愿者。病例组平均年龄为40.83±23.52岁。在病例组中观察到的活动评分(PASI)平均为9.3±8.8分。332例病例组中，早发患者≤40岁有200例，>40岁有132例。其中斑块状银屑病有304例，点滴状银屑病28例，伴有关节损害有127例，伴有指甲的损害有161例，有银屑病家族史57例，PASI评分≥10分有183例。病例组和对照组在年龄、性别上比较差异无统计学意义(P>0.05),详见表1。

表1 病例组和对照组年龄及性别分布

2.病例组和对照组间TNIP1/ANXA6基因多态性rs17728338和rs999556 位点基因型和等位基因分布频率比较：病例组与对照组间TNIP1/ANXA6基因多态性rs17728338位点的基因型、等位基因分布频率比较，二者之间差异有统计学意义(P<0.05)，病例组和对照组间rs999556位点的基因型、等位基因分布频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表2。

3.TNIP1/ANXA6 SNP基因型与等位基因在维吾尔族寻常型银屑病中临床表型的分布:TNIP1/ANXA6rs17728338、rs999556 的基因型、等位基因在维吾尔族寻常型银屑病患者临床表型(性别、患病年龄、分型、累及指甲、累及关节、家族史、病情轻重)进行分层比较所得χ2值、P值、OR(95% CI) 分布,见表3、表4。 TNIP1/ANXA6rs17728338位点分层分析中的基因型、等位基因在有家族史组与无家族史组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)，TNIP1/ANXA6rs17728338位点的基因型、等位基因在PASI评分≥10分和PASI评分<10分之间比较，差异有统计学意义(P<0.05)，在其他临床分层分析中比较，差异无统计学意义(P>0.05)。TNIP1/ANXA6rs999556的基因型、等位基因在年龄、分型、是否累及指甲、是否累及关节、家族史、病情轻重分层分析后发现差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 病例组及对照组TNIP1/ANXA6rs17728338、rs999556等位基因与基因频率分布

表3 TNIP1/ANXA6 rs17728338、rs999556基因型在维吾尔族寻常型银屑病中临床表型的分布

讨 论

研究认为银屑病是具有遗传背景的人群在环境的作用下，通过天然免疫系统过度活化引起的，银屑病表皮的过度增生就是皮肤天然免疫系统被过度激活的结果[4,5]。TNIP1基因通过TNF-α受体、表皮生长因子(EGF)受体和Toll样受体抑制核因子κB(NF-κB)信号转导。NF-κB是一种天然免疫应答中的关键转录因子，同时在银屑病患者体内TNIP1有一个被改变的甲基化模式导致TNIP1在银屑病皮肤上调[6]。TNIP1不仅仅是银屑病的易感基因位点，也是系统性红斑狼疮、干燥综合征和类风湿性关节炎的易感基因位点[7,8]。 ANXA6基因通过调节EGF受体相关的细胞转导信号通路，在细胞表面，EGF受体被激活后可以触发了复杂的网络，发出各种信号调节来调节角质形成细胞的分化，从而参与银屑病的发病过程[9，10]。Zhang等[11]通过GWAS证实TNIP1/ANXA6基因为汉族人寻常型银屑病的易感基因，这两个基因共同的易感位点rs3762999和rs999556和高加索人报道的rsl7728338均在同一区域。

表4 TNIP1/ANXA6rs17728338、rs999556等位基因在维吾尔族寻常型银屑病中临床表型的分布

*P<0.05

张丽君等[12]研究发现，ANXA6基因多态性rs999556和rs3762999与汉族人寻常型银屑病发病的易感性相关，rs999556与该病的临床类型相关，与发病年龄和家族史不相关；rs3762999与该病的发病年龄、家族史及临床类型均不相关 。本研究发现在维吾尔族银屑病患者TNIP1/ANXA6基因多态性rs999556位点与对照组等位基因及基因型频率差异均无统计学意义，且rs999556位点的基因型、等位基因与该病的临床类型、发病年龄、家族史、伴随的临床症状、疾病严重程度比较差异均无统计学意义，rs999556可能为汉族群体所独立具有的银屑病易感位点。而在病例组和对照组中rs17728338位点基因型、等位基因比较差异有统计学意义，提示TNIP1/ANXA6基因rs17728338位点是维吾尔族人群的易感位点，维吾尔族可能和汉族人群、高加索人群有着共同的致病位点，提示在这些不同种族人群中银屑病发病可能存在的共同机制。

韩建文等[3]研究发现，TNIP1基因区域的3个单核苷酸多态性(SNP)，即rs17728338、rs3762999和rs999556在465例汉族寻常性银屑病患者和476例健康对照组中比较差异有统计学意义，分层分析发现，rs17728338的基因型频率在早发型、晚发型、有家族史、无家族史寻常性银屑病组间比较差异均有统计学意义，而且均显示为显性遗传模式，提示TNIP1基因在银屑病发病机制中发挥着重要的作用，紧接着该项研究还证明了TNIP1基因的5个单核苷酸片段rs3805435、rs3792798、rs3792797、rs869976、rs17728338和rs999011在泛发性脓疱型银屑病病例组和对照组中差异有统计学意义，尤其是在没有寻常型银屑病皮损的患者中，但在掌跖脓疱病中没有差异性，从而证明TNIP1基因是泛发性脓疱型银屑病的易感基因[13]。本研究也证实了TNIP1/ANXA6基因rs17728338位点的基因型频率在有家族史及无家族史的维吾尔族寻常型银屑病患者中比较差异有统计学意义。证明了TNIP1/ANXA6基因多态性rs17728338对于家族史阳性的汉族、维吾尔族发病风险相对较大，与既往在汉族银屑病人群中研究结果相一致。

Zhang等[14]研究发现TNFAIP3基因rs610604基因多态性和寻常型银屑病的发生相关，患者病情分层分析(PASI≥6分和PASI<6分之间)发现上述两项差异仍有统计学意义。Indhumathi等[15]研究发现，在南印度泰米尔人群中360例寻常型银屑病患者和360例对照组中TNFAIP3(rs610604)、TNIP1 (rs17728338) 的基因多态性比较差异有统计学意义，其前者和家族史相关，后者和疾病的PASI评分可能相关，虽然显性模式下比较差异无统计学意义，但在基因型AA的频率上比较差异有统计学意义。本研究发现，TNIP1/ANXA6基因rs17728338的基因型、等位基因在病情分层分析(PASI≥10分和PASI<10分之间)比较差异有统计学意义，提示TNIP1/ANXA6基因多态性rs17728338和维吾尔族寻常型银屑病病情相关。而在性别、早发晚发、斑块状银屑病和点滴状银屑病、有无关节损害、有无指甲损害均未发现TNIP1/ANXA6基因多态性rs17728338的基因型、等位基因分布存在差异。

Yin等[16]研究发现,TNIP1/ANXA6基因多态性rs3762999(P=0.0257) 和 rs999556(P=0.0071)在饮酒和不饮酒汉族银屑病人群中比较，差异有统计学意义，在吸烟和不吸烟的汉族银屑病人群中 CSMD1基因多态性rs7007032 (P=0.0023)和rs10088247(P=0.0023) 比较，差异有统计学意义，此项研究进行了基因和环境交互作用的相关分析。本研究没有针对TNIP1/ANXA6基因多态性和维吾尔族银屑病人群的生活习惯相关性进行分析，可以在今后的研究中进一步证实。

综上所述，TNIP1/ANXA6基因rs17728338与维吾尔族寻常型银屑病发病的易感性相关，rs17728338对于家族史阳性的维吾尔族发病风险相对较大，且和维吾尔族寻常型银屑病病情相关。TNIP1/ANXA6基因多态性rs999556和维吾尔族寻常型银屑病发病的易感性不相关，与汉族人群研究结果不同，进一步证明了不同种族人群的遗传异质性。